核酸提取组合物及其应用，含有该核酸提取组合物的试剂、试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，特别涉及核酸提取组合物及其应用，含有该核酸提取组合物的试剂、试剂盒。本发明专利技术提供了一套不含挥发性有机溶剂的核酸提取纯化试剂，解决了含有挥发性有机溶剂对人体的危害性，使得操作变得极其简单，大大的提升了核酸提取纯化的时效性，最快可以在10分钟内获得核酸，获得的核酸可用于PCR、NASBA、LAMP、RPA等生物反应，且本发明专利技术的试剂可以从血液、咽拭子保存液、唾液、尿液、痰液、粪便等多种复杂样本中获取细胞、细菌、真菌、DNA病毒、RNA病毒的核酸，非常适宜临床应用及科研应用。

Nucleic acid extraction composition and its application, reagents and kits containing the nucleic acid extraction composition

【技术实现步骤摘要】
核酸提取组合物及其应用，含有该核酸提取组合物的试剂、试剂盒
本专利技术涉及生物
，特别涉及核酸提取组合物及其应用，含有该核酸提取组合物的试剂、试剂盒。
技术介绍
核酸提取技术是完成所有分子反应的第一步，该步骤完成的优劣直接影响后续生物反应能否成功。核酸的提取与纯化技术是分子生物学实验的一项基本技术，从最初的目的基因提取到PCR产物纯化或“胶回收”、以及基因克隆中质粒的提取等实验过程，都离不开核酸提取纯化。核酸分离纯化技术起源于20世纪50年代，在70年代和80年代中传统的核酸沉淀溶解分离纯化方法得到了普遍的应用和推广。常用的核酸提取纯化技术有Trizol法、离心柱法、磁珠法等方法，目前针对于这些方法所用到的核酸提取试剂均含有易挥发性有机溶剂。Trizol法利用DNA、RNA、蛋白质在有机层和水相层分布位置的不同而分离蛋白质与核酸，在获得核酸的过程中会用到苯酚、氯仿异戊醇、异丙醇、乙醇等对人体有害的挥发性有机溶剂，对操作人员存在较大的健康危害且Trizol法提取核酸步骤繁琐，对不同的样本提取效果重复性不佳，从样本裂解到获得核酸至少需要1.5h；因Trizol的有害性、操作繁琐、耗时长、与芯片不兼容等缺点，不宜在临床检测使用。常规的离心吸附柱及磁珠法提取核酸时也需要用乙醇或异丙醇进行结合，清洗时需要加入乙醇；这种加入醇类的方式使得核酸提取试剂在使用时操作相对复杂，耗时较长，且加入醇的试剂不能长时间保存，乙醇去除不干净还会一直后续反应且含乙醇的提取纯化试剂不适宜在微流控芯片上使用。因此，提供一套无需添加任何挥发性有机溶剂的提取试剂成分及其使用方法，快速高效的对多种样本中的总核酸进行提取纯化具有重要的现实意义。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了核酸提取组合物及其应用，含有该核酸提取组合物的试剂、试剂盒。本专利技术提供了一套无需添加任何挥发性有机溶剂的提取试剂成分及其使用方法，可快速高效的对多种样本中的总核酸进行提取纯化。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了核酸提取组合物，包括结合液和清洗液；所述结合液包括糖原、MOPS、多胺类物质和TCEP的组合物；所述清洗液包括盐酸胍、醋酸钾、糖原、MOPS、多胺类物质的组合物。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述结合液中糖原浓度为0.1%~1%（m/v）；MOPS浓度为10mM~20mM；多胺类物质包括精胺、亚精胺、丁二胺中的一种或两者以上的组合物，浓度为0.1%~2%（m/v）；TCEP浓度为5mM~50mM；所述结合液的pH为8.5~10。优选的，用硫酸氢钠调节溶液pH至8.5~10。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述清洗液中盐酸胍浓度为0.05M~0.6M；醋酸钾浓度为0.05M~0.5M；糖原浓度为0.01%~0.1%（m/v）；MOPS浓度为1mM~2mM；多胺类物质包括精胺、亚精胺、丁二胺中的一种或两者以上的组合物，浓度为0.01%~0.3%（m/v）；所述清洗液的pH为5~6。优选的，用硫酸氢钠调节溶液pH至5~6。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述核酸提取组合物还包括裂解液、加强剂、洗脱液中的一种或多种；所述裂解液包括异硫氰酸胍、TritonX-100中的一种或两者的混合物；所述加强剂包括蛋白酶k、海藻糖、氯化钙中的一种或两者以上的混合物；所述洗脱液包括氢氧化钠、1×TE溶液中的一种或两者的混合物。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述裂解液中异硫氰酸胍浓度为2M~8M；TritonX-100浓度为5%~20%（v/v）；pH值为3~6；和/或所述加强剂中蛋白酶k浓度为10mg/ml~25mg/ml；海藻糖浓度为3%~12%（m/v）；氯化钙浓度为5mM~20mM；所述洗脱液用氢氧化钠调节1×TE溶液的pH值为8~10。在上述研究的基础上，本专利技术还提供了所述的核酸提取组合物在制备核酸提取和/或核酸检测的工具中的应用；所述工具包括试剂和/或试剂盒。在上述研究的基础上，本专利技术提供了核酸提取试剂或核酸检测试剂，包括所述的核酸提取组合物以及检测中可接受的试剂。本专利技术还提供了核酸提取试剂盒或核酸检测试剂盒，包括所述的核酸提取组合物或所述的核酸提取试剂或核酸检测试剂以及检测中可接受的试剂或载体。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述载体包括硅基吸附柱、磁珠、玻璃珠、壳聚糖或二氧化硅修饰的载体。本专利技术还提供了用于非诊断目的的核酸提取方法或核酸检测方法，取待测样本与所述的核酸提取组合物或所述的核酸提取试剂或核酸检测试剂混合，提取和/或检测。本专利技术提供了一套不含挥发性有机溶剂的核酸提取纯化试剂，解决了含有挥发性有机溶剂对人体的危害性，使得操作变得极其简单，大大的提升了核酸提取纯化的时效性，最快可以在10分钟内获得核酸，获得的核酸可用于PCR、NASBA、LAMP、RPA等生物反应，且本专利技术的试剂可以从血液、咽拭子保存液、唾液、尿液、痰液、粪便等多种复杂样本中获取细胞、细菌、真菌、DNA病毒、RNA病毒的核酸，非常适宜临床应用及科研应用。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。图1示实施例1的扩增结果；其中，图1（A）示1000拷贝/µL；图1（B）示100拷贝/µL；图1（C）示10拷贝/µL；图1（D）示0拷贝/µL；图2示实施例2的扩增结果；其中，图2（A）示1000拷贝/µL；图2（B）示100拷贝/µL；图2（C）示10拷贝/µL；图2（D）示0拷贝/µL；图3示实施例3的扩增结果；其中，图3（A）示1000拷贝/µL；图3（B）示100拷贝/µL；图3（C）示10拷贝/µL；图3（D）示0拷贝/µL；图4示实施例4的扩增结果；其中，图4（A）示唾液样本中的EV71装甲RNA（104copies）经提取后RT-LAMP扩增；图4（B）示尿液样本中的EV71装甲RNA（104copies）经提取后RT-LAMP扩增；图5示实施例5的扩增结果；其中，图5（A）示唾液样本中的含DPV（鸭瘟）病毒1000copies/µL；图5（B）示唾液样本中的含DPV（鸭瘟）病毒100copies/µL；图5（C）示唾液样本中的含DPV（鸭瘟）病毒10copies/µL；图6示实施例6的扩增结果；其中，图6（A）示RT-LAMP扩增（唾液样本）；图6（B）示NASBA扩增（咽拭子样本），1为PC，2为甲流，3为甲流H1N1，4为IC；图6（C）示RT-PCR扩增（咽拭子样本）；图7示实施例7的扩增结果；其中，图7（A）示凯杰4000拷贝；图7（B）示本方法4000拷贝；图7（C）示凯杰400拷贝；图7（D）示本方法400拷贝；图7（E）示凯杰40拷贝；图7（F）示本方法40拷贝；图8示实施例8的扩增结果：其中，图8（A）示EV71扩增；图8（B）示鸭瘟扩增；图8本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.核酸提取组合物，其特征在于，由结合液、清洗液、裂解液、加强剂、洗脱液组成；所述结合液为糖原、MOPS、多胺类物质、TCEP的组合物；所述清洗液为盐酸胍、醋酸钾、糖原、MOPS、多胺类物质的组合物；/n所述结合液中糖原浓度为0.1%~1%（m/v）；MOPS浓度为10mM~20mM；多胺类物质包括精胺、亚精胺、丁二胺中的一种或两者以上的组合物，浓度为0.1%~2%（m/v）；TCEP浓度为5mM~50mM；/n所述结合液的pH为8.5~10；/n所述清洗液中盐酸胍浓度为0.05M~0.6M；醋酸钾浓度为0.05M~0.5M；糖原浓度为0.01%~0.1%（m/v）；MOPS浓度为1mM~2mM；多胺类物质包括精胺、亚精胺、丁二胺中的一种或两者以上的组合物，浓度为0.01%~0.3%（m/v）；/n所述清洗液的pH为5~6；/n所述裂解液选自异硫氰酸胍、TritonX-100中的一种或两者的混合物；/n所述加强剂选自蛋白酶k、海藻糖、氯化钙中的一种或两者以上的混合物；/n所述洗脱液选自氢氧化钠、1×TE溶液中的一种或两者的混合物；/n所述裂解液中异硫氰酸胍浓度为2M~8M；TritonX-100浓度为5%~20%（v/v）；pH值为3~6；和/或/n所述加强剂中蛋白酶k浓度为10mg/ml~25mg/ml；海藻糖浓度为3%~12%（m/v）；氯化钙浓度为5mM~20mM；/n所述洗脱液用氢氧化钠调节1×TE溶液的pH值为8~10；/n不包括挥发性有机溶剂。/n...

【技术特征摘要】
1.核酸提取组合物，其特征在于，由结合液、清洗液、裂解液、加强剂、洗脱液组成；所述结合液为糖原、MOPS、多胺类物质、TCEP的组合物；所述清洗液为盐酸胍、醋酸钾、糖原、MOPS、多胺类物质的组合物；
所述结合液中糖原浓度为0.1%~1%（m/v）；MOPS浓度为10mM~20mM；多胺类物质包括精胺、亚精胺、丁二胺中的一种或两者以上的组合物，浓度为0.1%~2%（m/v）；TCEP浓度为5mM~50mM；
所述结合液的pH为8.5~10；
所述清洗液中盐酸胍浓度为0.05M~0.6M；醋酸钾浓度为0.05M~0.5M；糖原浓度为0.01%~0.1%（m/v）；MOPS浓度为1mM~2mM；多胺类物质包括精胺、亚精胺、丁二胺中的一种或两者以上的组合物，浓度为0.01%~0.3%（m/v）；
所述清洗液的pH为5~6；
所述裂解液选自异硫氰酸胍、TritonX-100中的一种或两者的混合物；
所述加强剂选自蛋白酶k、海藻糖、氯化钙中的一种或两者以上的混合物；
所述洗脱液选自氢氧化钠、1×TE溶液中的一种或两者的混合物；
所述裂解液中异硫氰酸胍浓度为2M~8M；TritonX-100浓度为5%~20...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈翔，王磊，李素，郑隆堂，王亚南，文飞，辛娟，张闻天，程京，
申请(专利权)人：博奥生物集团有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11