污泥中胞内外DNA的分离方法及其携带耐药基因的检测方法技术

本发明专利技术涉及污水处理技术领域，尤其涉及分离污泥中胞内外DNA的方法及污泥中胞内外耐药基因的检测方法。本发明专利技术提供的方法联合离子交换树脂法和十二烷基苯磺酸钠‑高盐法提取污泥胞外、胞内DNA，该方法提取获得的胞内外DNA无明显交叉污染。采用特异性引物对提取产物扩增，可成功区分污泥中胞内外耐药基因，有望用于探究污泥中不同形态耐药基因的时空分布特征，并为今后开发相应的耐药基因风险评估方案和消除手段提供依据。

Isolation of intracellular and extracellular DNA from sludge and detection of drug-resistant genes

【技术实现步骤摘要】
污泥中胞内外DNA的分离方法及其携带耐药基因的检测方法
本专利技术涉及污水处理
，尤其涉及污泥中胞内外DNA的分离方法及其携带耐药基因的检测方法。
技术介绍
世界卫生组织和美国疾病与控制中心等组织一致将细菌“耐药性”列为二十一世纪人类健康的最大威胁之一。联合国环境署则将“耐药性”列为全球六大新兴环境问题之一。耐药基因是细菌获得耐药性的根本原因，故耐药基因的准确定量对于开发耐药性的风险评估方案和消除手段至关重要。在众多环境介质中，污水处理系统被证明是耐药基因重要储存库之一。在污水处理系统中，污泥内耐药基因按物理学形态可分为细胞内耐药基因和细胞外耐药基因。耐药基因形态不同，其环境行为特征亦不相同。然而，目前有关污水处理系统中耐药基因分布规律和消长特性的研究几乎均将污泥这一研究对象视作整体予以考虑，而未区分其形态。不同形态耐药基因的研究主要涉及前期不同形态DNA提取和后期不同形态耐药基因的定量检测。耐药基因的定量检测手段相对较为成熟和统一，但能够实现完整、无交叉污染的不同形态DNA的提取至今仍是一项极具挑战的任务。考虑到污泥中胞内和胞外耐药基因不同的繁殖模式、传播模式和消除难度，有必要开发不同形态耐药基因的定量检测方法。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术要解决的技术问题在于提供污泥中胞内外DNA的分离方法及其携带耐药基因的检测方法，该方法能够实现对胞内外DNA的良好分离，不存在显著交叉污染，因此能够实现对污泥中胞内外抗生素基因的准确检测。本专利技术提供了分离污泥中胞内外DNA的方法，其特征在于，包括：污泥沉淀与活化后的阳离子交换树脂(CER)混合，0～4℃500～800rpm搅拌反应4～8h后，离心分离上清液a和沉淀a；所述上清液a经醋酸纤维膜过滤，获得污泥胞外DNA粗提取液；所述沉淀a与胞内DNA抽提缓冲液混合，依次经蛋白酶K酶解、十二烷基苯磺酸钠(SDS)处理、SDS-DNA抽提缓冲液处理后，分离上清液b获得污泥胞内DNA粗提取液。本专利技术中，所述污泥沉淀与磷酸盐缓冲液重悬后，与活化的CER混合。所述污泥沉淀是指污泥样品经离心后所得的沉淀，其体积与污泥样品相等。所述磷酸盐缓冲液的包括：水和137mmol/LNaCl、2.7mmol/LKCl、10mmol/LNa2HPO4和1.8mmol/LKH2PO4组成。所述缓冲盐的pH值为7.2。本专利技术中，所述CER为DowexMarathonC钠型，每g挥发性污泥混合液悬浮固体(MLVSS)与60～80g所述CER混合。所述树脂的活化试剂采用磷酸盐缓冲液，活化在室温下进行，具体为18～30℃。活化时间为1h。活化后，10,000g、4℃离心5min，移除上清液，获得活化的树脂。具体实施例中，污泥与磷酸盐的混合液于4℃、600rpm搅拌反应6h后，10,000g、4℃离心15min离心分离上清液a和沉淀a；所述上清液a经醋酸纤维膜过滤时，滤膜孔径为0.22μm。所述沉淀a与胞内DNA抽提缓冲液和蛋白酶K混合，酶解后经三次SDS处理；所述沉淀a、DNA抽提缓冲液、蛋白酶K的比例为1g(湿重)∶2.7mL∶10μL；所述胞内DNA抽提缓冲液包括水和100mMTris-HCl、100mMEDTA、100mMNa2HPO4、1.5MNaCl和1％CTAB，pH值为8.0。所述蛋白酶K的浓度为10mg/mL，所述酶解的条件为37℃，225rpm搅拌30min。酶解后，离心弃上清获得所述酶解产物。所述三次SDS处理包括：第一次处理：酶解产物与20wt％SDS溶液混合，65℃孵育2h后，10000rpm离心10min，分离沉淀和上清液c；第二次处理：将第一次处理后的沉淀与20wt％SDS-DNA抽提缓冲液混合，65℃孵育10min后，10000rpm离心10min，分离沉淀和上清液d；第三次处理：将第二次处理后的沉淀与20wt％SDS-DNA抽提缓冲液混合，65℃孵育10min后，10000rpm离心10min，取上清液e；合并上清液c、d、e为上清液b。所述第一次SDS处理中，酶解产物与20wt％SDS溶液的比例为1g∶0.3mL；所述第二次SDS处理中，沉淀与20wt％SDS-DNA抽提缓冲液的比例为1g(湿重)∶0.1mL；所述第二次SDS处理中，沉淀与20wt％SDS-DNA抽提缓冲液的比例为1g(湿重)∶0.1mL。所述20wt％SDS-DNA抽提缓冲液为20wt％SDS溶液与DNA抽提缓冲液以体积比1∶9混合获得。本专利技术中，所述污泥胞内外DNA粗提取物还经过纯化的步骤。本专利技术中，所述污泥胞外DNA粗提取液依次经十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、高盐TE缓冲液、异丙醇、苯酚-氯仿-异戊醇、氯仿-异戊醇处理后，以乙酸钠-无水乙醇沉淀，再以乙醇溶液洗涤，最终获得纯化的胞外DNA。一些实施例中，所述CTAB处理包括：污泥胞外粗提取液与等体积的浓度为1wt％的CTAB溶液混合，65℃静置30min，然后于10,000g、4℃离心10min，取沉淀b。一些实施例中，所述高盐TE缓冲液处理包括：将沉淀b与高盐TE缓冲液混合在加入无水异丙醇后，0℃～4℃放置1h后10,000g、4℃离心10min，取沉淀c。其中，所述高盐TE缓冲液包括水和10mMTris-HCl、0.1mMEDTA、1MNaCl，pH为8.0；高盐TE缓冲液的体积与CTAB溶液相等，异丙酮与高盐TE缓冲液的体积比为0.6∶1。一些实施例中，所述苯酚-氯仿-异戊醇处理包括：将沉淀c与TE缓冲液混合后，加入苯酚∶氯仿∶异戊醇混合液。混匀后于4℃、10,000rpm离心10min，然后取上层水相a。所述TE缓冲液包括水和10mMTris-HCl、0.1mMEDTA组成，pH值为8.0；所述苯酚∶氯仿∶异戊醇混合液体积比为25∶24∶1；所述TE缓冲液与苯酚∶氯仿∶异戊醇混合液的体积比为1∶1。一些实施例中，所述氯仿-异戊醇处理包括：将上层水相a与氯仿-异戊醇混合，4℃、10,000rpm离心5min，取上层水相b；所述氯仿∶异戊醇混合液体积比为24∶1；所述氯仿∶异戊醇混合液与上层水相a的体积比为1∶1。一些实施例中，所述以乙酸钠-无水乙醇沉淀处理包括：将上层水相b与3mol/L乙酸钠溶液和预冷无水乙醇混合，0℃～4℃静置1h后，经14,000g、4℃离心10min，，取沉淀d。所述上层水相b、乙醇钠溶液和无水乙醇的体积比为10∶1∶20。一些实施例中，所述以乙醇洗涤处理包括：以乙醇溶液洗涤沉淀d。所述乙醇溶液浓度为70vol％，乙醇溶液洗涤次数为2次。本专利技术中，所述污泥胞内DNA粗提取液依次经苯酚-氯仿-异戊醇、氯仿-异戊醇处理后，以异丙醇沉淀后，再以乙醇溶液洗涤，获得纯化的胞内DNA。一些实施例中，所述苯酚-氯仿-异戊醇处理包括：将污泥胞内DNA粗提取液与苯酚∶氯仿∶异戊醇混合液混合，然后本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.分离污泥中胞内外DNA的方法，其特征在于，包括：/n污泥沉淀与活化后的阳离子交换树脂混合，0～4℃500～800rpm搅拌反应4～8h后，离心分离上清液a和沉淀a；/n所述上清液a经醋酸纤维膜过滤，获得污泥胞外DNA粗提取液；/n所述沉淀a与胞内DNA抽提缓冲液混合，依次经蛋白酶K酶解、20wt％十二烷基苯磺酸钠处理、20wt％十二烷基苯磺酸钠-DNA抽提缓冲液处理后，分离上清液b，获得污泥胞内DNA粗提取液。/n

【技术特征摘要】
1.分离污泥中胞内外DNA的方法，其特征在于，包括：
污泥沉淀与活化后的阳离子交换树脂混合，0～4℃500～800rpm搅拌反应4～8h后，离心分离上清液a和沉淀a；
所述上清液a经醋酸纤维膜过滤，获得污泥胞外DNA粗提取液；
所述沉淀a与胞内DNA抽提缓冲液混合，依次经蛋白酶K酶解、20wt％十二烷基苯磺酸钠处理、20wt％十二烷基苯磺酸钠-DNA抽提缓冲液处理后，分离上清液b，获得污泥胞内DNA粗提取液。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述阳离子交换树脂为DowexMarathonC钠型，每g挥发性污泥混合液悬浮固体与60～80g所述阳离子交换树脂混合。


3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述沉淀a与DNA抽提缓冲液和蛋白酶K混合，酶解后经三次十二烷基苯磺酸钠处理；
所述三次十二烷基苯磺酸钠处理包括：
第一次处理：酶解产物与20wt％十二烷基苯磺酸钠溶液混合，65℃孵育2h后，10000rpm离心10min，分离沉淀和上清液c；
第二次处理：将第一次处理后的沉淀与20wt％十二烷基苯磺酸钠溶液-DNA抽提缓冲液混合，65℃孵育10min后，10000rpm离心10min，分离沉淀和上清液d；
第三次处理：将第二次处理后的沉淀与20wt％十二烷基苯磺酸钠溶液-DNA抽提缓冲液混合，65℃孵育10min后，10000rpm离心10min，取上清液e；
合并上清液c、d、e为上清液...

【专利技术属性】
技术研发人员：周帅，张雨，高媛媛，唐振平，刘金香，
申请(专利权)人：南华大学，
类型：发明
国别省市：湖南;43