一种基于玻纤滤纸的病毒核酸提取方法技术

本发明专利技术公开了一种基于玻纤滤纸的病毒核酸提取方法，包括以下几个步骤：步骤一，在生物样本中加入蛋白酶K，快速混匀，得混合溶液；步骤二，加入结合缓冲液和Carrier RNA，上下颠倒充分混匀；步骤三，将混合液滴加在玻纤滤纸上，玻纤滤纸以双圈滤纸为支撑物固定，过滤的废液用吸水纸吸去；步骤四，用洗涤缓冲液清洗，再用吸水纸吸去废液；步骤五，在玻纤滤纸上滴加洗脱缓冲液，收集洗脱液即获得所需核酸。本方法将玻纤滤纸引入核酸抽提方法中，可以用于生物样本中核酸的富集和提取。该方法简化了核酸抽提的步骤和所需仪器设备，节省了操作时间，降低了提取成本，同时保证了高效的核酸回收率。

【技术实现步骤摘要】
一种基于玻纤滤纸的病毒核酸提取方法
本专利技术属于用于医学检测的样本核酸提取
，具体涉及一种从生物样本中快速提取核酸的方法，更具体涉及一种基于玻纤滤纸的病毒核酸提取方法。
技术介绍
血浆、血清和组织液等体液可被用于多种血源性传染病的主要检测分析样本。常见的血源性传染病有疟疾、慢性乙型病毒性肝炎、获得性免疫缺陷综合征等，这些疾病由寄生于人体血液和淋巴中的病原体所引起，主要透过血液、伤口的接触与交换将疾病传递至另一个体身上。因此通过提取并检测血液中病原体核酸含量，可帮助判定是否感染疾病、感染进程及预后状态等情况。玻璃纤维滤纸呈化学惰性，不含粘合剂，采用100％硼硅酸玻璃纤维制造而成。具有毛细纤维结构，能吸附比同等纤维素滤纸更多的水分，具有流速快，耐高温，纳污能力强的特点，并可以过滤细小的颗粒。作为玻璃钢制品的重要组成部分，玻璃纤维的应用非常广泛，其中滤纸的应用与日常生活非常紧密。在一定的离子环境下，核酸可被选择性地吸附到硅土、硅胶或玻璃表面而与其他生物分子分离。传统的核酸提取方法主要有：酚抽提法、碱裂解法、CTAB抽提法和EtBr-CsCl梯度离心法。这些传统提取方法可从不同组织样本中分离出核酸，但这些技术中包含沉淀和离心等操作步骤，其所需的生物样本量较大，且提取的步骤较为繁杂、费时费力，得率也不高。以固相吸附物载体为基础的新型核酸提取方法如旋转离心柱提取法、阴离子交换法、纳米磁珠提取法和玻璃粉吸附法等。其中离心柱提取法和纳米磁珠提取法得到了广泛运用，但不足的是离心柱法提取核酸需要反复离心，且需要离心机这样的仪器设备满足需求，而纳米磁珠提取法需要则外加磁场，且所需样本通常在200uL及以上，体积相对较大，且富集和洗脱过程较为繁琐。
技术实现思路
针对现有问题的不足，本专利技术的目的是提供一种基于玻纤滤纸的病毒核酸提取方法，能够实现现场快速提取和纯化核酸，操作方便。本专利技术解决其技术问题采用的技术方案是：为实现上述目的，本专利技术提出了一种基于玻纤滤纸的核酸提取方法，包括以下几个步骤：步骤一，在待提取核酸的生物样本中加入蛋白酶K，快速混匀，得混合溶液，蛋白酶K帮助裂解病毒以释放核酸；步骤二，在步骤一所得混合溶液中加入结合缓冲液和CarrierRNA，结合缓冲液帮助核酸吸附在玻纤膜上，核糖核酸载体帮助富集核酸；步骤三，将步骤二所得混合液滴加在玻纤滤纸上，玻纤滤纸以双圈滤纸为支撑物固定，过滤的废液用吸水纸吸去，此时所需核酸吸附在玻纤滤纸上；步骤四，用洗涤缓冲液清洗1～2次，用吸水纸吸去废液，目的是去除可能严重影响下游应用的任何残留污染物；步骤五，在玻纤滤纸上滴加洗脱缓冲液，收集过滤的洗脱液即获得所需核酸溶液。作为优选，所述步骤一中，蛋白酶K浓度为20-200ug/mL。作为优选，所述步骤二中，CarrierRNA浓度为1-8ug/mL，更优选的，所述CarrierRNA浓度为3-6ug/mL。作为优选，所述步骤二中，结合缓冲液主要包括1-8M盐酸胍、10-200mMTris-HCl、10-100mMEDTA、100-800mMNaCl、0.5％-2％SDS；更优选的，所述结合缓冲液主要包括2-8M盐酸胍、50-100mMTris-HCl、10-80mMEDTA、100-800mMNaCl、0.5％-1％SDS。更优选的，所述结合缓冲液中Tris-HCl的pH值为6.0-8.0。作为优选，所述步骤四中，洗涤缓冲液主要包括1-10mMEDTA、10-100mMTris-HCl、10-100mMNaCl和55％-75％乙醇。作为优选，所述步骤四中，洗脱缓冲液主要包括10-100mMTris-HCl、1-10mMEDTA。更优选的，所述洗脱缓冲液由10mMTris-HCl、1mMEDTA组成。作为优选，所述玻纤滤纸为100％硼硅酸玻璃纤维。作为优选，所述步骤三中，玻纤滤纸为圆形，直径为6-10mm，用PET单面透明胶带固定在双圈滤纸的亲水区域中。更优选的，所述玻纤滤纸的直径为6-8mm。作为优选，所述步骤三中，双圈滤纸包含喷蜡疏水区和亲水区，亲水区域为圆形，直径为8-12mm。作为优选，所述生物样本包括血清、血浆和组织液。有益效果本专利技术提供的一种基于玻纤滤纸的病毒核酸提取方法，与现有技术相比，具有以下有益效果：本方法引入玻纤滤纸直接吸附纯化核酸，该提取方法提取操作快速方便，不需要笨重的仪器设备，所需样本量小，可用于提取血清、血浆和组织液的核酸，使得核酸提取方法适用于现场检测。附图说明图1是本专利技术实施例1一种基于玻纤滤纸的核酸提取方法与全氏金磁珠法病毒组DNA\RNA试剂盒对血清中乙肝病毒核酸提取效率比较示意图；图2是本专利技术实施例2一种基于玻纤滤纸的核酸提取方法与全氏金磁珠法病毒组DNA\RNA试剂盒对血清中乙肝病毒核酸提取效率比较示意图；图3是本专利技术实施例3一种基于玻纤滤纸的核酸提取方法与将玻纤滤纸分别替换为双圈滤纸、fusion5的核酸提取方法对血清中乙肝病毒核酸提取效率比较示意图。具体实施方式以下结合实施例对本专利技术做进一步详细说明。所用试剂或者仪器设备未注明生产厂商的，均视为可以通过市场购买的常规产品。实施例1一种基于玻纤滤纸的核酸提取方法，包括以下几个步骤：步骤一，取两份含乙型肝炎病毒(HBV病毒)的血清50uL分别放置于1.5mL离心管作为实验组1(并标记为HBV11、HBV16)中作为待提取核酸的生物样本，加入5uL蛋白酶K后快速混匀，得混合溶液；步骤二，在步骤一所得混合溶液中加入80uL结合缓冲液和0.7uLCarrierRNA，混匀后室温孵育10分钟；步骤三，将步骤二所得混合液滴加在玻纤滤纸上，滤纸下垫上吸水纸，过滤的废液用吸水纸吸去；步骤四，在上述玻纤滤纸上缓慢滴加125uL洗涤缓冲液，滤纸下垫上吸水纸，过滤的废液用吸水纸吸去，在通风处晾干不超过10分钟；步骤五，在上述玻纤滤纸上滴加30uL洗脱缓冲液，将过滤的溶液收集在1.5mL离心管中，即获得所需的核酸，所需核酸可进行下一步实验或在-20℃温度保存；其中，蛋白酶K浓度为80ug/mL，CarrierRNA浓度为6ug/mL；结合缓冲液由6M盐酸胍、50mMTris-HCl、20mMEDTA、500mMNaCl和0.5％SDS组成，洗涤缓冲液由10mMEDTA、50mMTris-HCl(pH6.5)、100mMNaCl和75％乙醇组成，洗脱缓冲液由10mMTris-HCl(pH8.0)和1mMEDTA组成，玻纤滤纸为100％硼硅酸玻璃纤维且直径为6mm。设置与上述实验组数量相同的对照组1，采用全氏金磁珠法病毒组DNA\RNA试剂盒，取样体积为200uL，洗脱体积为120uL，并完成对照组核酸的提取。对对照组1和采用本专利技术提取方法提取的核酸量采用Nan本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于玻纤滤纸的核酸提取方法，其特征在于：包括以下几个步骤：/n步骤一，在待提取核酸的生物样本中加入蛋白酶K，快速混匀，得混合溶液；/n步骤二，在步骤一所得混合溶液中加入结合缓冲液和Carrier RNA；/n步骤三，将步骤二所得混合液滴加在玻纤滤纸上，玻纤滤纸以双圈滤纸为支撑物固定，过滤的废液用吸水纸吸去；/n步骤四，用洗涤缓冲液清洗，再用吸水纸吸去废液；/n步骤五，在玻纤滤纸上滴加洗脱缓冲液，收集过滤的洗脱液即获得所需核酸溶液。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于玻纤滤纸的核酸提取方法，其特征在于：包括以下几个步骤：
步骤一，在待提取核酸的生物样本中加入蛋白酶K，快速混匀，得混合溶液；
步骤二，在步骤一所得混合溶液中加入结合缓冲液和CarrierRNA；
步骤三，将步骤二所得混合液滴加在玻纤滤纸上，玻纤滤纸以双圈滤纸为支撑物固定，过滤的废液用吸水纸吸去；
步骤四，用洗涤缓冲液清洗，再用吸水纸吸去废液；
步骤五，在玻纤滤纸上滴加洗脱缓冲液，收集过滤的洗脱液即获得所需核酸溶液。


2.如权利要求1所述的基于玻纤滤纸的核酸提取方法，其特征在于：所述步骤三中，玻纤滤纸为圆形，直径为6-10mm，用PET单面透明胶带固定在双圈滤纸的亲水区域中。


3.如权利要求1或2所述的基于玻纤滤纸的核酸提取方法，其特征在于：所述步骤三中，双圈滤纸包含喷蜡疏水区和亲水区，亲水区域为圆形，直径为8-12mm。


4.如权利要求1或2所述的基于玻纤滤纸的核酸提取方法，其特征在于：所述步骤一中，蛋白酶K浓度为20-100ug/mL。


5.如权利要求1或2所述的基于玻纤滤纸的核酸提取方法，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘斐，李嘉豪，单衍可，李悦，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32