【技术实现步骤摘要】
一种分子克隆中提高酶切产物浓缩效率的方法
本专利技术涉及生物工程
,特别涉及一种分子克隆中提高酶切产物浓缩效率的方法。
技术介绍
分子克隆过程中,酶切是重要步骤,在合适的Buffer中,加入内切酶在37℃进行酶切,时间根据目的片段的大小而定,结束后对酶进行80℃失活处理。为了获得较多的酶切产物,除了扩大酶切体积,对产物进行电泳验证以外,还要进行切胶回收检测回收效率如何。此时的酶切产物可能存在蛋白、其他DNA片段杂质污染,因此,对酶切产物纯化浓缩可大大提升浓度,提高克隆效率。应用最广的酶切产物浓缩法是乙醇沉淀法。在中等浓度单价阳离子存在下,加入一定量的乙醇后,所形成有核酸沉淀可经离心而回收,甚至对低至pg量的DNA或RNA,也可定量回收,回收的核酸可按所需浓度,再溶于适当的缓冲液中。但传统方法中由于乙醇浓缩过程中作用易造成片段不稳定。另外,若乙醇处理过程中若风干不彻底,本身对片段就有很大损伤。因此,若处理不当,易对于酶切产物段质量造成严重影响,并且乙醇处理片段时间较久,延长整个分子克隆的时间,影响实验进程。加入的醋酸钠作用是其中Na+和RNA分子上的负电荷结合,降低RNA分子之间的排斥作用,易于互相聚合而形成RNA-钠盐沉淀,排除RNA污染。异丙醇的存在将消除核酸的水化层,使带负电荷的磷酸基团更好的暴露,它本身有亲水性,因此加入后能夺取酶切产物周围的水分,因此DNA片段能都发生聚集沉淀。加入糖元是因为糖元会和DNA形成大分子网状结构,三者共同促进DNA沉淀。因此,我们提出一种分子克 ...
【技术保护点】
1.一种分子克隆中提高酶切产物浓缩效率的方法,其步骤具体如下:/n步骤一:收集切胶回收后的酶切产物100μL;/n步骤二:配制3M醋酸钠溶液备用;/n步骤三:加入3M10μL醋酸钠溶液到总反应体系中;/n步骤四:加入异丙醇100μL至反应体系中;/n步骤五:加入糖元1μL至反应体系中;/n步骤六:室温下反应20min;/n步骤七:将反应物离心12000rpm,10min;/n步骤八:弃上清,去离子水孵育后得到浓缩后酶切产物;/n步骤九:取3μL浓缩后酶切产物检测其A260:A280。/n
【技术特征摘要】
1.一种分子克隆中提高酶切产物浓缩效率的方法,其步骤具体如下:
步骤一:收集切胶回收后的酶切产物100μL;
步骤二:配制3M醋酸钠溶液备用;
步骤三:加入3M10μL醋酸钠溶液到总反应体系中;
步骤四:加入异丙醇100μL至反应体系中;
步骤五:加入糖元1μL至反应体系中;
步骤六:室温下反应20min;
步骤七:将反应物离心12000rpm,10min;
步骤八:弃上清...
【专利技术属性】
技术研发人员:鲁倩倩,安文强,秦娇,汤永永,陆曼,薛金嫚,
申请(专利权)人:北京银丰鼎诚生物工程技术有限公司,
类型:发明
国别省市:北京;11
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