一种无RNA污染的植物基因组DNA高效提取方法技术

本发明专利技术公开了一种无RNA污染的植物基因组DNA高效提取方法，CTAB抽提缓冲液水浴中预热；叶片置于研钵中，研磨；加入抽提缓冲液和β‑巯基乙醇；温浴；加入酚/氯仿/异戊醇，在摇床上充分混匀后离心；轻轻地吸取上清液，在上清液中加入RNaseA溶液，去除RNA；加入酚/氯仿/异戊醇；离心取上清液，在离心管中加等体积已预冷的异丙醇，冷冻；离心，立即倒掉液体；直立离心管，加入乙醇；倒掉液体，再加入乙醇，将DNA漂洗；离心，立即倒掉液体，干燥DNA；灭菌水溶解；置于‑20℃保存、备用。本发明专利技术以水稻叶片为材料，通过改进基因组DNA提取方法，在提取时间、DNA提取量、RNA残留等方面具有较大优势。

An efficient method of DNA extraction from plant genome without RNA pollution

【技术实现步骤摘要】
一种无RNA污染的植物基因组DNA高效提取方法
本专利技术属于生物
，涉及一种无RNA污染的植物基因组DNA高效提取方法。
技术介绍
在分子生物学和遗传学领域，基因组是指生物体所有遗传物质的总和。这些遗传物质包括DNA或RNA(病毒RNA)。基因组包括编码DNA和非编码DNA、线粒体DNA和叶绿体DNA。研究基因组DNA，要求提取的DNA具有较高的纯度和得率，以便于PCR、基因组测序以及基因探测等后续研究。在DNA提取过程中，影响其纯度和得率的原因很多。现有技术中，急需一种无RNA污染的植物基因组DNA高效提取方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种无RNA污染的植物基因组DNA高效提取方法。其具体技术方案为：一种无RNA污染的植物基因组DNA高效提取方法，包括以下步骤：(1)2％CTAB抽提缓冲液在65℃水浴中预热。(2)取少量叶片(约1g)置于研钵中，用液氮磨至粉状，将300mg左右的粉末转移到2.0ml离心管中。(3)加入800μl2％CTAB抽提缓冲液和20μl1％β-巯基乙醇，轻轻搅动混匀。(4)置于65℃的水浴槽或恒温箱中温浴，每隔10min轻轻摇动，30min后取出。(5)加入800μl酚/氯仿/异戊醇(25/24/1)，在摇床(90rpm/min)上充分混匀10min后，12000rpm离心5min。(6)离心结束后，吸取500μl上清液，转入另一新的2.0ml离心管中。(7)在500μl上清液中加入10μlRNaseA溶液(10mg/ml)，在摇床上充分混匀，去除RNA。(8)混匀15min后，加入500μl酚/氯仿/异戊醇，摇床上充分混匀；(9)混匀10min后，12000rpm离心5min，取上清液至另一新的2.0ml离心管中，在离心管中加等体积已在-20℃冰箱中预冷的异丙醇，置-20℃冰箱冷冻20min。(10)冷冻20min后，12000rpm离心2min，立即倒掉液体，注意勿将白色DNA沉淀倒出，将离心管倒立于铺开的纸巾上。(11)2min后，直立离心管，加入800μl75％乙醇，轻轻转动，用手指弹管尖，使沉淀于管底的DNA块状物浮游于液体中，漂洗5min。(12)12000rpm离心1min，倒掉液体，再加入800μl75％乙醇，将DNA漂洗5min。(13)12000rpm离心1min，立即倒掉液体，将离心管倒立于铺开的纸巾上；数分钟后，直立离心管，干燥DNA。(14)加入100μl灭菌水溶解。(15)置于-20℃保存、备用。进一步，步骤6中，在第一次抽提的上清液中加入RNaseA溶液消解RNA。与现有技术相比，本专利技术的有益效果：在提取过程消解RNA，提取的DNA中无RNA污染。目前，关于植物基因组DNA的提取常规方法有SDS法、CTAB法，到后续发展起来的碱处理法、高温水煮法，以及生物公司开发出的一些基因组DNA提取试剂盒。采用传统方法提取DNA质量、浓度较高，但是操作过程复杂，降低试验效率，难以适应分子标记和基因定位是需要大批量提取DNA的要求。而且DNA提取中混有提取过程中残留的杂质。而在构建基因组文库过程中，如果DNA纯度不够，例如混有酚、酒精等杂质，对酶切、连接均有抑制作用，导致文库滴度大大降低。因此，本专利技术以水稻叶片为材料，通过改进基因组DNA提取方法，在提取时间、DNA提取量、RNA残留等方面具有较大优势。附图说明图1是DNA的琼脂糖凝胶电泳图。其中，泳道“1～3”分别是方法1、2、3提取的DNA电泳效果图；泳道“M”为TRANS生物技术有限公司生产的5kbDNAmarker，8条带的大小依次为5kb、3kb、2kb、1.5kb、1kb、800bp、500bp、300bp。图2是3种方法提取DNA的PCR扩增结果。其中，泳道“1～3”分别是方法1、2、3提取DNA的PCR产物；泳道“M”为TRANS生物技术有限公司生产的DNAmarkerⅠ，8条带的大小依次为700bp、600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp。图3是3种方法提取DNA酶切电泳图。其中，泳道“1”、“3”、“5”分别是方法1、2、3提取DNA的酶切产物；泳道“2”、“4”、“6”分别是方法1、2、3提取的DNA；泳道“M”为TRANS生物技术有限公司生产的DNAmarkerⅠ，8条带的大小依次为700bp、600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术的技术方案作进一步详细地说明。1材料与方法1.1材料以水稻叶片为试验材料。1.2水稻的培育与取样水稻育苗采用湿润育秧。播种前待浸种催芽两天，破胸露白后播在育苗床上。水稻幼苗长至4叶1心，取水稻幼叶，锡箔纸包裹于液氮中速冻，置-80℃保存备用。1.3水稻基因组DNA提取的方法方法1为改进后方法，具体步骤如下：(1)2％CTAB抽提缓冲液在65℃水浴中预热。(2)取少量叶片(约1g)置于研钵中，用液氮磨至粉状，将300mg左右的粉末转移到2.0ml离心管中。(3)加入800μl2％CTAB抽提缓冲液和20μl1％β-巯基乙醇，轻轻搅动混匀。(4)置于65℃的水浴槽或恒温箱中温浴，每隔10min轻轻摇动，30min后取出。(5)加入800μl酚/氯仿/异戊醇(25/24/1)，在摇床上(90rpm/min)充分混匀10min后，12000rpm离心5min。(6)离心结束后，吸取500μl上清液，转入另一新的2.0ml离心管中。(7)在500μl上清液中加入10μlRNaseA溶液(10mg/ml)，在摇床上充分混匀10min，以去除RNA。(8)混匀15min后，加入500μl酚/氯仿/异戊醇，摇床上充分混匀；(9)混匀10min后，12000rpm离心5min，取上清液至另一新的2.0ml离心管中，在离心管中加等体积已在-20℃冰箱中预冷的异丙醇，置-20℃冰箱冷冻20min。(10)冷冻20min后，12000rpm离心2min，立即倒掉液体，注意勿将白色DNA沉淀倒出，将离心管倒立于铺开的纸巾上。(11)2min后，直立离心管，加入800μl75％乙醇，轻轻转动，用手指弹管尖，使沉淀于管底的DNA块状物浮游于液体中，漂洗5min。(12)12000rpm离心1min，倒掉液体，再加入800μl75％乙醇，将DNA漂洗5min。(13)12000rpm离心1min，立即倒掉液体，将离心管倒立于铺开的纸巾上；数分钟后，直立离心管，干燥DNA。(14)加入100μl灭菌水溶解。(15)置于-20℃保存、备用。方法2参照卢扬江等简易的DNA提取方法，操作步骤稍作修本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种无RNA污染的植物基因组DNA高效提取方法，其特征在于，包括以下步骤：/n(1)2％CTAB抽提缓冲液在65℃水浴中预热；/n(2)取1g叶片置于研钵中，用液氮磨至粉状，将300mg的粉末转移到2.0ml离心管中；/n(3)加入800μl 2％CTAB抽提缓冲液和20μl 1％β-巯基乙醇，轻轻搅动混匀；/n(4)置于65℃的水浴槽或恒温箱中温浴，每隔10min轻轻摇动，30min后取出；/n(5)加入800μl酚/氯仿/异戊醇，在摇床上以90rpm/min的速度充分混匀10min后，12000rpm离心5min；/n(6)离心结束后，吸取500μl上清液，转入另一新的2.0ml离心管中；/n(7)在500μl上清液中加入10μl浓度为10mg/ml的RNaseA溶液，在摇床上充分混匀，以去除RNA；/n(8)15min后，加入500μl酚/氯仿/异戊醇，摇床上充分混匀；/n(9)混匀10min后，12 000rpm离心5min，取上清液至另一新的2.0ml离心管中，在离心管中加等体积已在-20℃冰箱中预冷的异丙醇，置-20℃冰箱冷冻20min；/n(10)冷冻20min后，12 000rpm离心2min，立即倒掉液体，注意勿将白色DNA沉淀倒出，将离心管倒立于铺开的纸巾上；/n(11)2min后，直立离心管，加入800μl 75％乙醇，轻轻转动，用手指弹管尖，使沉淀于管底的DNA块状物浮游于液体中，漂洗5min；/n(12)12 000rpm离心1min，倒掉液体，再加入800μl 75％乙醇，将DNA漂洗5min；/n(13)12 000rpm离心1min，立即倒掉液体，将离心管倒立于铺开的纸巾上；数分钟后，直立离心管，干燥DNA；/n(14)加入100μl灭菌水溶解；/n(15)置于-20℃保存、备用。/n...

【技术特征摘要】
1.一种无RNA污染的植物基因组DNA高效提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)2％CTAB抽提缓冲液在65℃水浴中预热；
(2)取1g叶片置于研钵中，用液氮磨至粉状，将300mg的粉末转移到2.0ml离心管中；
(3)加入800μl2％CTAB抽提缓冲液和20μl1％β-巯基乙醇，轻轻搅动混匀；
(4)置于65℃的水浴槽或恒温箱中温浴，每隔10min轻轻摇动，30min后取出；
(5)加入800μl酚/氯仿/异戊醇，在摇床上以90rpm/min的速度充分混匀10min后，12000rpm离心5min；
(6)离心结束后，吸取500μl上清液，转入另一新的2.0ml离心管中；
(7)在500μl上清液中加入10μl浓度为10mg/ml的RNaseA溶液，在摇床上充分混匀，以去除RNA；
(8)15min后，加入500μl酚/氯仿/异戊醇，摇床上充分混匀；
(9)混匀10min后，12000rpm离心5mi...

【专利技术属性】
技术研发人员：周会汶，吴兰花，宋英培，王春娥，王瑞凯，周海霞，周筱玲，
申请(专利权)人：九江学院，
类型：发明
国别省市：江西;36