一种提取强酸性条件下基质微生物总RNA和总蛋白的方法技术

本发明专利技术公开了一种提取强酸性条件下基质微生物总RNA和总蛋白的方法，属于分子生物学技术领域。本发明专利技术的方法包括以下步骤：1)取基质材料，采用pH＝3.6～5.5的缓冲溶液A在一定压力的水压下冲洗基质材料，将微生物从附着基质表面上洗脱，离心收集菌体；2)将步骤1)收集的菌体裂解，采用溶液B提取总RNA和总蛋白，所述溶液B为pH＝4.0～4.5的Trizol试剂。所述水压压力范围为30～120MPa。本发明专利技术提取方法显著改善了强酸性条件下基质附着微生物总RNA和总蛋白的提取效率和质量，满足同时提取或分别提取RNA和蛋白质的检测要求。

A method of extracting total RNA and protein from stromal microorganism under strong acid condition

【技术实现步骤摘要】
一种提取强酸性条件下基质微生物总RNA和总蛋白的方法
本专利技术涉及分子生物学
，具体涉及分别或同时提取强酸性条件下基质微生物总RNA和总蛋白的方法。
技术介绍
核糖核酸(RNA)是以DNA双链中的一条为模板转录，形成的一条单链生物大分子，主要功能是实现基因(DNA)中的遗传信息到蛋白质的表达，即遗传信息向表型转化的桥梁。对RNA的测定相较于DNA的测定，主要用于衡量生物体某一基因，或整个基因组在某一时间、环境下的表达水平。近年来，针对某一环境中微生物应对特定环境压力、污染物暴露或其他刺激因素对微生物群落生态功能的影响，基于新型分子生物学技术的各类RNA检测技术获得了长足的发展，实时荧光定量核酸扩增检测qPCR法、RNA芯片，乃至对总RNA进行测序的宏转录组技术得到了广泛地应用。和RNA相比，蛋白质是更为直接的实现生命活动的有机大分子，同时也是构成细胞基本骨架的有机物之一。因此，蛋白质是生命的物质基础，没有蛋白质就没有生命，它是与生命及与各种形式的生命活动紧密联系在一起的物质。机体中的每一个细胞的几乎所有重要组成部分，以及细胞的所有重要生命过程都有蛋白质参与。近年来，针对某一环境中微生物应对特定环境压力、污染物暴露或其他刺激因素对微生物群落生态功能的影响，基于新型分子生物学技术的各类蛋白质检测技术也获得了长足的发展，蛋白质印迹法(WesternBlot)、酶联免疫吸附法(ELISA)，乃至基于质谱和数学分析的对总蛋白进行测定的宏蛋白组学技术得到了深入的发展和广泛的应用。RNA和蛋白质检测的主要挑战之一是RNA或蛋白质的提取和纯化，由于RNA和蛋白质在生物体内不断合成和分解，以应对环境因素的改变，因此RNA或蛋白质的提取对取样时间点的把控要求严格。并且由于环境中(如人手和空气中)广泛存在RNA酶，在提取过程中极易引入体系中，因此RNA的提取需要格外小心，需要控制提取时样品的环境温度，缩短提取时间，提高提取效率，以避免RNA的降解。对于蛋白质而言，由于蛋白酶广泛存在于动物内脏、植物茎叶、果实和微生物中，因此对于蛋白质的提取需要避免蛋白酶的作用。对于强酸性环境(pH<3)中的微生物样品总RNA或总蛋白的提取纯化，还存在极端环境会为微生物带来严重的生存压力，微生物菌体一旦破裂，强酸性会导致RNA在极短的时间内降解为短链的小片段，或是引发蛋白质变性或水解为小片段，或自溶液中沉淀出去的问题。为了适应复杂生境，微生物自身会产生特殊的聚合酶，组成生物膜、菌团等共同抵抗复杂生境下的生存压力。但环境中存在的各种抑制物(氢离子、腐植酸、酚类化合物和重金属离子等)在低pH值条件下会影响微生物的酶活性，并导致核糖核酸分子的不稳定，直接引发蛋白质的变性和RNA的水解，环境样品中广泛存在的腐植酸类物质，由于其大分子的结构与核糖核酸或蛋白质部分类似，因此腐植酸类物质会与这两种生物大分子紧密结合，从而导致被共提取，引入杂质，进一步加大了下游实验的难度。目前很多研究者采取了不同的方法预处理微生物样品，使其满足总RNA或总蛋白提取的需要。这些方法主要可分为两类，一种是在微生物生长的原始位置，通过依次添加不同的试剂，对总RNA进行提取的原位提取法。经检索，现有技术公开了相关的申请案，如中国专利公开号为CN105018472A的申请案中公开了一种在栽培基质上紧密嵌合的菌丝体中RNA的提取方法，取布满菌丝体的培养基粗研后，采用含有溶菌酶和蛋白酶K的pH＝5.5～6.5的PBS缓冲液震荡分离菌丝和菌体，离心收集沉淀，再以含有EDTA、SDS的pH＝5.5～6.5的PBS缓冲液洗涤并进一步收集游离RNA后，用Trizol法提取RNA，获得的RNA质量较好。再如中国专利公开号为CN101921341A的申请案公开了一种提取土壤样品总蛋白的方法，通过直接将土壤样品加入蛋白提取液(曲拉通TritonX-100的EDTA-DTT-焦磷酸钠碳酸缓冲液)，室温振荡提取0.5～2.0小时，离心后上清液中获得提取的蛋白质。另一种是将附着的微生物或细胞从生长的基质上洗脱或剥离下来，再进行提取的异位提取法，如中国专利公开号为CN109234270A中的申请案中公开了一种对贴壁培养的细胞，先用RNA提取溶液，裂解细胞表面，再使用移液器吹打细胞并移至收集管中，之后通过加入氯仿分层，以提取RNA的方法。虽然上述不同研究者使用的提取方法已得到公开，但是尚未有针对环境溶液pH<3的中强酸性环境中，提取环境样品总RNA和总蛋白的方法。而且不同于纯培养液环境，附着于固态基质上的环境样品中，重金属和腐植酸等杂质含量较高、成分复杂，造成寻求通用方法更加困难。因此，对于酸性溶液条件下的生物膜填料塔上的微生物来说，研究一种有针对性的、合适的核糖核酸提取方法是很有必要的。
技术实现思路
1.要解决的问题针对强酸性(pH<3)条件下微生物极易失活、必须依托生物膜、菌胶团或多孔基质进行生命活动，且失活后细胞膜/壁破裂导致微生物染色体快速降解和蛋白变性，进而引发RNA长链分子碎片化和蛋白水解变性，造成RNA和蛋白提取产率低、质量差的问题；另外，由于RNA的等电点为约pH＝2～2.5之间，在pH<3的条件下容易自溶液中沉淀析出，进一步降低了提取液中RNA的浓度，导致最终提取物难以满足上机测序、qPCR，或WesternBlot及宏蛋白组等技术前处理需要的问题，本专利技术的方法采用pH＝3.6～5.5的缓冲液在一定水压下将菌体从基质上冲洗脱落，菌体裂解后，再采用pH＝4.0～4.5的Trizol试剂进行RNA和蛋白质的提取，显著改善了强酸性条件下基质附着微生物总RNA和总蛋白的提取效率和质量。2.技术方案为了解决上述问题，本专利技术所采用的技术方案如下：本专利技术提供了一种提取强酸性条件下基质附着微生物总RNA和总蛋白的方法，包括以下步骤：1)取基质材料，采用pH＝3.6～5.5的缓冲溶液A在一定压力的水压下冲洗基质材料，将微生物从附着基质表面上洗脱，离心收集菌体；2)将步骤1)收集的菌体裂解，采用溶液B提取总RNA和总蛋白，所述溶液B为pH＝4.0～4.5的Trizol试剂。作为本专利技术更进一步的改进，所述基质表面包括可供微生物附着生长的基质材料外表面或通过破碎材料使之暴露于外的微生物附着生长的内表面，所述总RNA为基质表面附着的所有微生物的RNA总和，所述总蛋白为基质表面附着的所有微生物的蛋白总和。作为本专利技术更进一步的改进，所述步骤1)离心速度为5000g，离心时间2分钟，离心温度4℃。作为本专利技术更进一步的改进，所述步骤1)中水压压力范围为30～120MPa。作为本专利技术更进一步的改进，所述菌体裂解方法包括冻融法、超声法或液氮研磨法。作为本专利技术更进一步的改进，所述步骤1)中缓冲溶液A的冲洗体积为10～100mL，洗脱时间不超过90秒。作为本专利技术更进一步的改进，所述步骤1)中缓冲溶液A的冲洗体积为300mL，适宜压力为120MPa。作为本专利技术更本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种提取强酸性条件下基质附着微生物总RNA和总蛋白的方法，其特征在于：包括以下步骤：/n1)取基质材料，采用pH＝3.6～5.5的缓冲溶液A在一定压力的水压下冲洗基质材料，将微生物从附着基质表面上洗脱，离心收集菌体；/n2)将步骤1)收集的菌体裂解，采用溶液B提取总RNA和总蛋白，所述溶液B为pH＝4.0～4.5的Trizol试剂。/n

【技术特征摘要】
1.一种提取强酸性条件下基质附着微生物总RNA和总蛋白的方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)取基质材料，采用pH＝3.6～5.5的缓冲溶液A在一定压力的水压下冲洗基质材料，将微生物从附着基质表面上洗脱，离心收集菌体；
2)将步骤1)收集的菌体裂解，采用溶液B提取总RNA和总蛋白，所述溶液B为pH＝4.0～4.5的Trizol试剂。


2.根据权利要求1所述的提取强酸性条件下基质附着微生物总RNA和总蛋白的方法，其特征在于：所述步骤1)中水压压力范围为30～120MPa。


3.根据权利要求1或2所述的提取强酸性条件下基质附着微生物总RNA和/总蛋白的方法，其特征在于：所述步骤1)中缓冲溶液A的冲洗体积为10～100mL。


4.根据权利要求3所述的提取强酸性条件下基质附着微生物总RNA和总蛋白的方法，其特征在于：所述方法还包括总RNA和总蛋白的纯化步骤。


5.根据权利要求4所述的提取强酸性条件下基质附着微生物总RNA和总蛋白的方法，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：李侃，任鑫坤，张徐祥，王庆，任洪强，
申请(专利权)人：南京大学，南京大学宜兴环保研究院，
类型：发明
国别省市：江苏;32