一种转录组建库的方法、试剂和应用技术

本申请公开了一种转录组建库的方法、试剂和应用。本申请的转录组建库方法包括，采用带U碱基的引物对cDNA进行PCR扩增，然后对扩增产物进行酶切将U碱基消化去除，制备具有黏性末端的PCR扩增产物，利用所制备的黏性末端，与含有互补黏性末端的接头互补连接，即获得转录组文库。本申请的转录组建库方法，在cDNA的PCR扩增引物中引入U碱基，通过一组酶先进行U碱基酶切，产生黏性末端，再利用酶切得到的黏性末端与接头连接，此过程在一管中一步完成；减少了Pacbio全长转录组建库步骤和操作环节，缩短了建库时间，并降低建库成本。

A method, reagent and application of transcriptome Library

【技术实现步骤摘要】
一种转录组建库的方法、试剂和应用
本申请涉及转录组基因测序领域，特别是涉及一种转录组建库的方法、试剂和应用。
技术介绍
基因组和转录组测序是生命科学领域的基础性工作。由于绝大部分非模式生物缺乏基因组数据，全长转录组测序就变得尤为重要，全长转录本可以大大促进这些物种的基因功能、基因表达调控和进化关系等多方面的基础与应用研究。当前，绝大多数的转录组数据都是基于第二代高通量测序技术获得的。然而，第二代测序技术测序序列短，短序列拼接无法提供大量的长转录本并且丢失了可变剪接等重要信息，因而转录组的从头测序开始采用PacBio第三代测序技术。在2013年PacBioRSII推出时，其通量较低，测序成本一直让科研人员望而止步。到2015年10月，PacBio推出Sequel平台，大幅提升了全长转录组的测序通量，在通量上是PacBioRSII的5-10倍。鉴于三代测序技术在科研甚至临床领域的发展潜力，很多公司相继引入Sequel平台，提供Pacbio三代测序的全长转录组测序服务。目前Pacbio三代测序的全长转录组按照Pacbio公司推出的标准方案来进行，过程如图1所示，主要包括两个方面：cDNA的制备和转录组建库。其中，cDNA的制备包括使用Clontech公司的SMARTerPCRcDNASynthesisKit试剂盒，将RNA反转录生成cDNA。转录组建库，如图1和图2所示，包括对cDNA进行PCR，PCR产物经过DNA损伤修复、末端修复、磁珠纯化、接头连接、酶消化去除不完整文库、磁珠纯化共六个步骤，获得可以用于后续测序的转录组测序文库；这六个步骤至少需要在三个反应管中进行总计约3h的反应。总的来说，现有的转录组建库方法过程复杂、建库时间长、成本高，不利于全长转录组的广泛深入研究和应用。
技术实现思路
本申请的目的是提供一种新的转录组建库的方法、试剂和应用。本申请采用了以下技术方案：本申请的一方面公开了一种转录组建库的方法，包括采用带U碱基的引物对cDNA进行PCR扩增，然后对扩增产物进行酶切将U碱基消化去除，制备具有黏性末端的PCR扩增产物，利用所制备的黏性末端，与含有互补黏性末端的接头互补连接，即获得转录组文库。其中，含有互补黏性末端的接头是指，该接头上带有互补黏性末端的序列，即能够与U碱基消化后产生的黏性末端互补匹配，从而将接头连接到PCR扩增产物上。需要说明的是，本申请的转录组建库方法，其关键在于采用带U碱基的引物进行cDNA的PCR扩增，至于前期的cDNA制备，以及后续的互补连接后的酶消化去除不完整文库等步骤与现有的建库方法相同。本申请的转录组建库方法，由于采用带U碱基的引物进行cDNA的PCR扩增，使得U碱基消化去除、接头连接可以在一个反应管中一步完成，包括后续的酶消化去除不完整文库和纯化，整个建库流程除RT-PCR以外，只需要三个步骤，并且三个步骤无需转换反应管，在一个反应管中即可先后完成，反应时间总计约1.5h，如图3所示；与现有的转录组建库需要在三个反应管中进行总计约3h的六个步骤的反应相比，本申请的转录组建库方法不仅缩减了建库流程，缩短了建库时间，提高了建库效率，而且相应的减小了建库的试剂和时间成本。还需要说明的是，本申请的关键在于利用带U碱基的引物进行PCR扩增，然后通过U碱基消化PCR扩增产物产生的黏性末端与接头连接；该专利技术思路不仅限于转录组建库，同样也适用于基因组文库的构建，例如采用带U碱基的随机引物对基因组进行扩增，然后利用相同的思路进行U碱基消化去除和加接头；又例如，采用带U碱基的特异性引物对靶标序列进行扩增富集，然后进行U碱基消化去除和加接头。优选的，本申请的转录组建库方法中，酶切将U碱基消化去除采用的酶包括Uracil-DNAGlycosylase和EndonucleaseVIII。需要说明的是，Uracil-DNAGlycosylase和EndonucleaseVIII只是本申请的一种实现方式中具体采用的将U碱基消化去除的酶；可以理解，只要能够将U碱基消化去除，并且能够产生黏性末端，都可以用于本申请，不仅限于Uracil-DNAGlycosylase和EndonucleaseVIII。优选的，本申请的转录组建库方法中，酶切将U碱基消化去除的步骤和与含有互补黏性末端的接头互补连接的步骤采用一步法完成，其中，一步法包括将酶切消化去除U碱基的试剂、接头互补连接的试剂、接头和cDNA的PCR扩增产物加入到一个反应体系中一步反应完成酶切和加接头。需要说明的是，本申请的转录组建库方法，将酶切产生黏性末端和加接头反应在一个反应体系中进行，只需一步就同时完成了酶切和加接头，不仅简化了操作步骤，节约了程序，提高了效率，而且也减小了因反复操作引起的误差和可能造成的污染。优选的，本申请的转录组建库方法还包括，在加接头的同一反应容器中，对加接头的产物依序进行外切酶消化和文库纯化，获得可以直接用于测序的转录组文库。需要说明的是，本申请的转录组建库方法中，外切酶消化是指采用外切酶对不完整文库，即文库中没有连接接头的DNA片段或没有连接DNA的接头，进行酶切消化，去除这些片段或多余的接头，避免其对后续测序造成影响。本申请的一种实现方式中，具体采用了核酸外切酶I和核酸外切酶III进行外切酶消化去除不完整文库。文库纯化是指对外切酶消化的产物进行纯化，以便于用于后续的测序，本申请的一种实现方式中具体采用磁珠纯化，即直接在外切酶消化产物中加入磁珠进行纯化。因此，本申请的转录组建库方法中，一步法加接头、酶消化去除不完整文库和文库磁珠纯化，三个步骤可以在一个反应容器中进行，不需要转管，并且，经过三个步骤后的产物可以直接用于上机测序。还需要说明的是，本申请的转录组建库方法中，接头互补连接的作用是，在PCR产物的黏性末端与接头的黏性末端通过碱基互补配对后，利用互补连接的酶，将PCR产物与接头连接为一个整体。本申请的一种实现方式中具体采用的是TaqDNAligase，可以理解，不排除还可以使用其它具有类似功能的酶，例如T4DNAligase。优选的，本申请的转录组建库方法中，带U碱基的引物为SeqIDNo.1所示序列，SeqIDNo.1:5’-AAGCAGUGGUAUCAACGCAGAGTAC-3’。优选的，本申请的转录组建库方法中，接头为SeqIDNo.2所示序列，SeqIDNo.2:5’-ACGTCAATCTCTCTCTTTTCCTCCTCCTCCGTTGTTGTTGTTGAGAGAGATTGACGTAAGCAGTGGTAT-3’。需要说明的是，SeqIDNo.1所示序列的引物和SeqIDNo.2所示序列的接头，也只是本申请的一种实现方式中具体采用的引物和接头；可以理解，只要引物和接头具有能够在U碱基消化切除后互补的黏性末端即可，至于具体的黏性末端的序列或黏性末端以外的其它序列，可以根据使用需求而设计，在此不作具体限定。例如本申请的一种实现方式中，具体采用SeqIDNo.1所示序列的引物进行cDNA的PC本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种转录组建库的方法，其特征在于：包括采用带U碱基的引物对cDNA进行PCR扩增，然后对扩增产物进行酶切将U碱基消化去除，制备具有黏性末端的PCR扩增产物，利用所制备的黏性末端，与含有互补黏性末端的接头互补连接，即获得转录组文库。/n

【技术特征摘要】
1.一种转录组建库的方法，其特征在于：包括采用带U碱基的引物对cDNA进行PCR扩增，然后对扩增产物进行酶切将U碱基消化去除，制备具有黏性末端的PCR扩增产物，利用所制备的黏性末端，与含有互补黏性末端的接头互补连接，即获得转录组文库。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述酶切将U碱基消化去除，采用的酶包括Uracil-DNAGlycosylase和EndonucleaseVIII。


3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：酶切将U碱基消化去除的步骤和与含有互补黏性末端的接头互补连接的步骤采用一步法完成，所述一步法包括将酶切消化去除U碱基的试剂、接头互补连接的试剂、接头和cDNA的PCR扩增产物加入到一个反应体系中一步反应完成酶切和加接头；
优选的，所述方法还包括，在加接头的同一反应容器中，对加接头的产物依序进行外切酶消化和文库纯化，获得可以直接用于测序的转录组文库。


4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于：所述带U碱基的引物为SeqIDNo.1所示序列，
SeqIDNo.1:5’-AAGCAGUGGUAUCAACGCAGAGTAC-3’。


5.根据权利要求1-3任一项所述的方...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐冲，陈智超，郭梅，石卓兴，杨林峰，高强，
申请(专利权)人：深圳华大基因科技服务有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44