【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】测定设备及其使用方法相关申请本申请要求2017年8月31日提交的美国临时申请第62/552,588号的权益和优先权，其全部内容通过引用并入本文。
技术介绍
在美国、加拿大和西欧，传染病占人类死亡率的约7％，而在发展中地区，传染病占人类死亡率的40％以上。传染病导致各种临床表现。常见的明显表现包括发烧、肺炎、脑膜炎、腹泻和含血的腹泻。尽管物理表现提示一些病原体并消除其他病原体作为病原因子，但仍存在各种潜在的致病因子，并且明确诊断通常需要进行多种测定。用于诊断病原体的传统微生物学技术可能需要数天或数周，通常会延迟正确的治疗过程。近年来，聚合酶链式反应(PCR)已成为快速诊断感染因子的首选方法。PCR可以是诊断传染病的快速、灵敏和特异的工具。然而，使用PCR作为主要诊断手段的挑战是可能的致病生物体或病毒的多样性以及一些病理标本中存在的生物体或病毒的低水平。进行多组PCR测定，每组针对一种可能的致病生物体或病毒，通常是不切实际的，其中大多数预计是阴性的。当病原体核酸浓度低并且需要大量样品来收集足够的反应模板时，问题就更加严重。在一些情况下，没有足够的样品来测定所有可能的病原因子。一种解决方案是进行“多重PCR”，其中在单一反应中同时测定样品的多个靶标。尽管已经证明多重PCR在一些系统中是有价值的，但是存在关于高水平多重反应的稳健性和难以清楚分析多种产物的缺点。为了解决这些问题，可以随后将测定分成多重二次PCR。在初级产物中嵌套二次反应提高稳健性。诸如(BioFireDiagnostics，LLC，盐湖城，犹他州)的封闭式系统减少了
【技术保护点】
1.一种用于扩增样品中的核酸的方法，包括：/n提供一种容器，包括多功能室和流体连接至所述多功能室的第一反应区，所述容器包含位于其中的用于样品制备、核酸回收和第一阶段核酸扩增反应的磁性颗粒和试剂，其中，所述磁性颗粒和所述试剂流体连接至所述多功能室或所述第一反应区或两者；/n将所述样品引入所述多功能室；/n在所述多功能室中实施至少两个步骤，其中所述步骤包括：/n(1)裂解前使所述样品与所述磁珠接触，/n(2)在所述磁性颗粒的存在下生成裂解物，/n(3)使核酸与所述磁性颗粒结合，/n(4)分离所述磁性颗粒和所述裂解物，/n(5)对与所述裂解物分离的所述磁性颗粒实施至少一次洗涤，以及/n(6)在第一阶段核酸扩增反应系中扩增核酸。/n
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170831 US 62/552,5881.一种用于扩增样品中的核酸的方法，包括：
提供一种容器，包括多功能室和流体连接至所述多功能室的第一反应区，所述容器包含位于其中的用于样品制备、核酸回收和第一阶段核酸扩增反应的磁性颗粒和试剂，其中，所述磁性颗粒和所述试剂流体连接至所述多功能室或所述第一反应区或两者；
将所述样品引入所述多功能室；
在所述多功能室中实施至少两个步骤，其中所述步骤包括：
(1)裂解前使所述样品与所述磁珠接触，
(2)在所述磁性颗粒的存在下生成裂解物，
(3)使核酸与所述磁性颗粒结合，
(4)分离所述磁性颗粒和所述裂解物，
(5)对与所述裂解物分离的所述磁性颗粒实施至少一次洗涤，以及
(6)在第一阶段核酸扩增反应系中扩增核酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述多功能室提供有裂解颗粒。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，在所述多功能室中实施的步骤选自以下组：
步骤(1)和(2)；
步骤(1)、(2)和(3)；
步骤(1)-(4)；
步骤(2)和(3)；以及
步骤(2)、(3)和(4)。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中，在所述多功能室中实施的步骤选自以下组：
步骤(3)和(4)；
步骤(3)、(4)和(5)；
步骤(4)、(5)和(6)；以及
步骤(5)和(6)。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述实施步骤包括步骤(3)，并且步骤(3)还包括在生成所述裂解物时向所述样品施加热。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述实施步骤包括步骤(2)，其中，所述裂解物在用于使所述核酸与所述磁性颗粒结合的条件下生成。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述实施步骤包括步骤(2)，其中，所述裂解物在裂解温度生成，并且所述核酸在受控温度下从所述裂解物中回收，其中，所述裂解温度范围为40℃-100℃，优选为50℃-100℃，或更优选为70℃-100℃，并且其中，所述受控温度低于所述裂解温度并且范围为0℃-60℃，优选为0℃-50℃，或更优选为0℃-40℃。
8.根据权利要求1或2所述的方法，还包括：
其中，所述实施步骤包括步骤(3)和(4)，并且步骤(4)还包括将所述磁性颗粒从所述多功能室移动至所述第一反应区，
其中，所述实施步骤包括步骤(5)，并且步骤(5)在所述第一反应区中实施，其中，所述洗涤包括将洗涤缓冲液注入至所述第一反应区中，将所述磁珠分散在所述洗涤缓冲液中，重新捕获所述磁珠，并排出所述洗涤缓冲液，以及
其中，所述实施步骤包括步骤(6)，并且步骤(6)在所述第一反应区中实施。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，在实施步骤(3)和(4)之后，所述裂解颗粒保留在所述多功能室中。
10.根据权利要求8所述的方法，还包括在步骤(5)之后将核酸扩增试剂添加到所述第一反应区中，并且其中，在步骤(6)之前没有洗脱步骤。
11.根据权利要求1所述的方法，所述实施步骤包括步骤(3)、(4)和(5)，其中：
步骤(3)和(4)还包括将所述裂解物排出到废物室，以及
步骤(5)在所述多功能室中实施，其中步骤(5)包括将洗涤缓冲液注入至所述多功能室中，将所述磁珠分散在所述洗涤缓冲液中，重新捕获所述磁珠，以及排出所述洗涤缓冲液。
12.根据权利要求11所述的方法，其中，步骤(6)是所述多功能室中的第一阶段多重核酸扩增反应，其中，在所述扩增步骤之前没有洗脱步骤。
13.根据权利要求1所述的方法，其中，所述容器还包括流体连接至所述多功能室的第二阶段反应区，所述第二阶段反应区包括多个第二阶段反应孔，每个第二阶段反应孔包括配置用于进一步扩增所述样品的一对引物，所述第二阶段反应区配置用于同时对全部所述多个第二阶段反应室进行热循环。
14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述第二阶段反应区经由所述第一反应区流体连接至所述多功能室。
15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述实施步骤包括步骤(6)，并且还包括将所述第一阶段核酸扩增反应系的一部分与用于第二阶段核酸扩增反应的试剂组合以形成第二阶段核酸扩增混合物，用所述第二阶段核酸扩增混合物填充每个所述第二阶段反应孔，并在所述第二阶段反应区的多个第二阶段反应孔中实施第二阶段核酸扩增反应以生成一种或多种扩增子。
16.根据权利要求16所述的方法，还包括：如果所述样品中存在一种或者多种生物体，使用所述一种或多种扩增子来鉴定所述生物体。
17.根据权利要求1所述的方法，其中，所述挠性容器还包括与所述多功能室流体连通的样品接收室。
18.根据权利要求17所述的方法，还包括：用样品拭子收集样品，将所述拭子插入至所述样品接收室中并密封所述样品接收室和其中的所述拭子，用注入到所述样品接收室中的样品裂解缓冲液将所述样品分散在所述样品接收室中，并且将所述样品和所述样品裂解缓冲液转移至所述多功能室中。
19.根据权利要求1所述的方法，其中，所述用于样品制备、核酸回收和第一阶段核酸扩增的磁性颗粒和试剂提供在一个或多个液体填充的试剂泡状结构中、在一个或多个干燥的试剂泡状结构中、或它们的组合中。
20.根据权利要求1所述的方法，其中，所述实施步骤包括步骤(2)，并且还包括：在步骤(2)之后，将所述多功能室中的所述裂解颗粒与所述裂解物隔离开。
21.根据权利要求1所述的方法，其中，所述实施步骤包括步骤(3)，并且还包括：在步骤(3)之后，隔离所述多功能室中的所述磁性颗粒。
22.一种用于在封闭系统中对样品实施核酸扩增的容器，所述容器包括：
第一层和第二层，所述第一层和所述第二层限定在其间的多功能室，所述容器提供有用于样品制备、核酸回收和第一阶段核酸扩增反应的磁性颗粒和试剂，其中，所述磁性颗粒提供在流体连接至所述多功能室的室中或提供在所述多功能室中，并且其中，所述试剂提供在流体连接至所述多功能室的室中；以及
第二阶段反应区，其设置在所述第一层和所述第二层之间并且流体连接至所述多功能室，所述第二阶段反应区包括多个第二阶段反应室，每个第二阶段反应室包含配置用于进一步扩增所述样品的一对引物，所述第二阶段反应区配置用于同时对全部所述多个第二阶段反应室进行热循环。
23.根据权利要求22所述的容器，其中，所述多功能室提供有细胞裂解组分和所述磁性颗粒。
24.根据权利要求23所述的容器，其中，所述细胞裂解组分包括裂解颗粒或裂解颗粒。
25.根据权利要求22所述的容器，其中，所述容器还包括与所述多功能室流体连通的样品裂解室，其中，所述样品裂解室提供有细胞裂解组分和所述磁性颗粒，并且所述多功能室提供有磁珠洗涤组分和第一阶段核酸扩增组分。
26.根据权利要求25所述的容器，还包括位于所述样品裂解室和所述多功能室之间的过滤器。
27.根据权利要求26所述的容器，其中，所述过滤器具有尺寸设计为保留所述裂解颗粒并允许所述磁珠通过的孔隙度。
28.根据权利要求26所述的容器，其中，通道连接所述样品裂解室和所述多功能室，并且所述过滤器横跨所述通道位于所述第一层和所述第二层之间。
29.根据权利要求28所述的容器，其中，所述过滤器比所述通道宽。
30.根据权利要求26所述的容器，其中，通道在所述样品裂解室和所述多功能室之间延伸，并且所述过滤器位于所述样品裂解室中邻近所述通道处。
31.根据权利要求30所述的容器，其中，所述通道小于所述样品裂解室，并且所述过滤器比所述通道宽。
32.根据权利要求22所述的容器，其中，所述磁性颗粒是核酸结合的磁性颗粒。
33.根据权利要求22所述的容器，还包括与所述多功能室流体连通的样品接收室。
34.根据权利要求33所述的容器，其中，所述样品接收容器包括样品收集拭子。
35.根据权利要求34所述的容器，其中，所述样品收集拭子包括伸长杆，其中，所述样品接收室和所述拭子的所述伸长杆由化学相容性材料制成，所述化学相容性材料能够至少部分地与热密封件融合。
36.根据权利要求22所述的容器，其中，所述磁性颗粒和所述试剂提供在与所述多功能室流体连通的一个或多个试剂泡状结构中。
37.根据权利要求36所述的容器，其中，所述试剂泡状结构的一个或多个是液体填充的试剂泡状结构，并且在制造所述容器时被填充。
38.根据权利要求36所述的容器，其中，所述试剂泡状结构的一个或多个包含设置在所述试剂泡状结构中的干燥试剂。
39.根据权利要求36所述的容器，还包括位于所述试剂泡状结构和所述多功能室之间的可打开的密封件。
40.根据权利要求39所述的容器，其中，所述可打开的密封件是可破裂的密封件。
41.根据权利要求39所述的容器，其中，所述可打开的密封件是贴合在一起的膜密封件。
42.一种独立的反应容器，包括：
第一反应区，其流体连接至第二反应区，其中，所述第二反应区包括：
第一层、其中形成有多个第二阶段反应孔的卡层、和第二层，
其中，所述第一层设置在所述多个第二阶段反应孔的第一端的上方并将其密封，以及所述第二层设置在所述多个第二阶段反应孔的相对的第二侧的上方并将其密封；
填充通道，其将所述第一反应区流体连接至所述第二反应区的所述多个第二阶段反应孔；
其中，所述填充通道至少部分地形成为所述第二层和所述卡层之间的空间，并且所述填充通道还形成进入每个所述多个第二阶段反应孔中的回旋流动路径，以抑制所述第二阶段反应区中的孔之间的流体连通。
43.根据权利要求42所述的独立的反应容器，所述填充通道包括形成在所述卡层、所述第二层、或所述卡层和所述第二层的组合中的通道，其中，所述填充通道分别将全部所述第二阶段反应孔流体连接至所述第一阶段反应区。
44.根据权利要求42所述的独立的反应容器，还包括结合至所述第二层的第三层，其中，所述第二层包括穿孔层，其具有流体连接至所述多个第二阶段反应孔的多个穿孔，并且其中，所述填充通道形成为所述第二层和所述第三层之间的空间。
45.根据权利要求44所述的独立的反应容器，其中，用于每个第二阶段反应孔的所述回旋流动路径包括在所述第二层中的开口，所述开口邻近第二阶段反应孔但不与所述第二阶段反应孔对齐，并且与所述卡层中邻近第二阶段反应孔但不与所述第二阶段反应孔对齐的切口流体连通。
46.根据权利要求44所述的独立的反应容器，其中，用于每个第二阶段反应孔的所述回旋流动路径包括在所述第二层中的邻近第二阶段反应孔但不与所述第二阶段反应孔对齐的开口，所述开口与所述卡层中的基本垂直的切口流体连通，所述基本垂直的切口邻近第二阶段反应孔并从第二膜层延伸至所述卡层中的邻近所述第一层的基本水平的切口，并且创建从所述开口至所述基本垂直的切口并进入到所述第二阶段反应孔中的流体导管。
47.根据权利要求42所述的独立的反应容器，其中，所述填充通道是可热密封的。
48.根据权利要求47所述的独立的反应容器，其中，单个热密封件密封从填充通道至多个第二阶段反应孔的流，并将所述第二阶段反应孔彼此密封。
49.根据权利要求42所述的独立的反应容器，其中，所述填充通道还包括稀释区，其包括位于所述填充通道中的介于所述第一反应区和第二反应区之间的稀释孔，其中，所述稀释孔配置为接收来自所述第一反应区的反应产物的体积部分，将所述体积部分与稀释介质组合以形成组合的体积部分，并用所述组合的体积部分填充所述第二反应区的所述多个第二阶段反应孔。
50.根据权利要求49所述的独立的反应容器，所述稀释区还包括与所述稀释孔流体连通的稀释泡状结构，其中所述稀释泡状结构配置为接收所述稀释介质，将所述体积部分与所述稀释介质组合，并且填充所述第二反应区的所述多个第二阶段反应孔。
51.一种独立的反应容器，所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：K·M·赖里，A·D·韦尔内雷尔，C·P·巴斯科，A·拉尤恩，C·瓦雄，A·杜邦菲拉德，L·梅斯塔，A·C·哈奇，E·W·休恩，D·E·琼斯，
申请(专利权)人：拜奥法尔防护有限责任公司，拜奥法尔诊断有限责任公司，生物梅里埃公司，
类型：发明
国别省市：美国;US
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