用于识别和表征T细胞受体和T细胞抗原的工程化的多组件系统技术方案

本发明专利技术涉及一种多组件系统，其中第一组件是称为组件A的工程化的抗原呈递细胞(eAPC)，第二组件是称为组件C的遗传供体载体，用于递送一种或多种编码分析物抗原‑呈递复合体(aAPX)和/或分析物抗原分子(aAM)的ORF，其中组件Aa.缺乏aAPX和/或aAM的至少一个家族的内源表面表达和b.包含至少两个基因组接收位点，称为组件B和组件D，每个用于整合至少一个编码至少一个aAPX和/或aAM的ORF，并且组件C与组件B匹配，并且其中组件C被设计为递送c.单个编码至少一个aAPX和/或aAM的ORF，或d.两个或更多个编码至少一个aAPX和/或aAM的ORF，其中基因组接收位点B和D是设计用于重组蛋白介导的交换(RMCE)的合成构建体。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于识别和表征T细胞受体和T细胞抗原的工程化的多组件系统专利
本专利技术涉及多组件系统的构建、组装和使用，所述多组件系统包含至少三种组件，所述组件是工程化的抗原呈递细胞(eAPC)，工程化的基因组接收位点和匹配的遗传供体载体。本专利技术用于快速、高通量地产生呈递多种形式的抗原分子的稳定的衍生细胞，用于识别和表征这些抗原和同源TCR序列。本专利技术的介绍T淋巴细胞(T细胞)的免疫监视是所有下颚脊椎动物适应性免疫的核心功能。通过T细胞亚型间丰富功能多样性实现T细胞的免疫监视，其用于消除病原体感染和肿瘤细胞并协调对入侵病原体、共生微生物、共生非自身因子如食品的分子成分的适应性免疫应答，甚至保持自身的免疫耐受性。为了应答各种外来和自身因子，T细胞必须能够特异性地检测这些外来和自身因子的分子成分。因此，T细胞必须能够检测个体遇到的大面积的自身和非自身分子，具有足够的特异性以引起对抗致病性器官和患病自身的有效反应，同时避免引起这种针对健康自身的反应。当考虑到外来和自身分子几乎无限的多样性时，这项任务的高度复杂本性变得清晰，并且病原生物正处于逃避T细胞检测的进化压力下。T细胞受体(TCR)T细胞主要由T细胞受体(TCR)的表达来定义。TCR是T细胞的组成部分，其负责与T细胞适应性免疫的靶标相互作用并且感测它。一般而言，TCR由呈递在细胞表面上的异二聚体蛋白质复合体组成。两条TCR链中的每一条由两个细胞外结构域组成，即可变(V)-区和恒定(C)-区，两者都是免疫球蛋白超家族(IgSF)结构域，形成反平行β-片层。它们通过I型跨膜结构域锚定在细胞膜中，所述I型跨膜结构域邻接短的细胞质尾部。适应和检测不同分子成分的T细胞的质量来自T细胞发生过程中产生的TCR链的变异。这种变异是通过体细胞重组以与B细胞中抗体发生相似的方式产生的。TCR链多样性T细胞池由几个功能和表型异质的亚群组成。然而，根据它们在其表面表达的体细胞重排的TCR形式，T细胞可广义地分类为αβ或γδ。存在两种TCR链对形式；TCRα(TRA)和TCRβ(TRB)对；以及TRCγ(TRG)和TCRδ(TRD)对。表达TRA:TRB对的T细胞称为αβT细胞，而表达TRG:TRD对的T细胞通常称为γδT细胞。αβ和γδ形式的TCR负责不同的配体或'抗原'的识别，并且每个T细胞在T细胞成熟期间从头产生αβ或γδ受体链。这些从头产生的TCR链对通过在称为体细胞V(D)J重组的过程中通过产生受体序列多样性来实现识别的多样性，其中每个T细胞表达单个明显重排的TCR的拷贝。在TRA和TRG基因座处，许多离散的可变(V)和功能性(J)基因区段可用于重组并与恒定的(C)基因区段并置，因此称为VJ重组。在TRB和TRD基因座的重组另外包括多样性(D)基因区段，并且被称为VDJ重组。每个重组TCR拥有唯一配体特异性的潜力，其通过在αβT细胞的情况下由α和β链形成的配体结合位点的结构或在γδT细胞的情况下由γ和δ链形成的配体结合位点的结构决定。TCR的结构多样性主要局限于每条链上的三个短发夹环，称为互补决定区(CDR)。从受体链对的每条链贡献三个CDR，并且这六个CDR环共同位于TCR细胞外结构域的膜-远端以形成抗原结合位点。每种TCR链中的序列多样性以两种模式实现。首先，用于重组的基因区段的随机选择提供了碱基序列多样性。例如，TRB重组发生在47个唯一的V，2个唯一的D和13个唯一的J种系基因区段之间。通常，V基因区段贡献CDR1和CDR2环两者，因此是种系编码的。产生序列多样性的第二种模式发生在高变CDR3环内，其通过在重组V，(D)和J基因区段之间的连接处随机缺失模板核苷酸和添加非模板核苷酸而产生。TCR:CD3复合体成熟的αβ和γδTCR链对呈递在具有许多辅助CD3亚基(表示为ε、γ、δ和ζ)的复合体的细胞表面。这些亚基与αβ或γδTCR结合为三个二聚体(εγ、εδ、ζζ)。该TCR:CD3复合体形成了在αβ或γδTCR与同源抗原接合时启动细胞信号传导反应的单元。缔合为TCR:CD3复合体的CD3辅助物贡献了被称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)的信号基序。CD3ε、CD3γ和CD3δ各自贡献单个ITAM，而CD3ζ同二聚体含有3个ITAM。因此，与TCR组装的三个CD3二聚体(εγ、εδ、ζζ)贡献10个ITAM。在TCR与同源抗原连接后，串联酪氨酸残基的磷酸化为含有Src同源性2(SH2)结构域的蛋白质(例如70kDa的关键ζ链相关蛋白(ZAP-70))产生成对的停靠位点。这些蛋白质的再次募集启动TCR:CD3信号传导复合体的形成，其最终负责T细胞活化和分化。αβT细胞αβT细胞通常在人类中比其γδT细胞对应物更丰富。大多数αβT细胞与细胞表面上由HLA复合体呈递的肽抗原相互作用。这些肽-HLA(pHLA)识别T细胞是第一个被描述的并且是迄今为止被最佳表征的。还描述了更罕见形式的αβT细胞。粘膜相关的不变T(MAIT)细胞似乎具有相对有限的α和β链多样性，并且识别细菌代谢物而不是蛋白质片段。不变的自然杀伤T细胞(iNKT细胞)和种系编码的分枝酰基反应性T细胞(GEMT细胞)限于识别由非HLA分子交叉呈递的糖脂。iNKT细胞主要被认为与CD1d呈递的糖脂相互作用，而GEMT细胞与CD1b呈递的糖脂相互作用。认为其他形式的T细胞在CD1a和CD1c的背景下与糖脂相互作用，然而，这些细胞尚未以显著的细节表征。常规αβT细胞大多数αβT细胞的关键特征是在HLA分子的背景下识别肽抗原。这些通常被称为“常规”αβT细胞。在个体内，自身HLA分子将自身和外来蛋白质的肽呈递给T细胞，为针对恶性肿瘤和外来病原体的适应性免疫，对共生生物、食品和自身的适应性耐受提供必要的基础。编码HLA蛋白的HLA基因座是人类基因组中最基因密集和多态的区域，并且在人类中描述了超过12,000个等位基因。HLA基因座中的高度多态性确保了个体之间肽抗原呈递的多样性，这对于群水平的免疫是重要的。HLAI类和II类有两种形式的经典HLA复合体：HLAI类(HLAI)和HLAII类(HLAII)。有三种经典的HLAI基因：HLA-A，HLA-B，HLA-C。这些基因编码跨膜α链，其与不变的β2-微球蛋白(β2M)链缔合。HLAIα链由具有免疫球蛋白折叠的三个结构域组成：α1，α2和α3。α3结构域是近膜的并且大部分是不变的，而α1和α2结构域一起形成多态性膜-远端抗原结合裂隙。有六种经典的HLAII基因：HLA-DPA1、HLA-DPB1、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DRA和HLA-DRB1。这些基因编码包含α链和β链的配对DP、DQ和DR异二聚体HLA复合体。每条链具有两个具有免疫球蛋白折叠的主要结构结构域，其中α2和β2结构域包含与HLAIα3结构域类似的近膜和大部分不变的模块。HLAIIα2和β2结构域一起形成膜远端抗原结合裂隙并且是高多态性的区域。HLAI和HLAII的抗原结合裂隙在八个反平行β-片层的平台上包含两个反平行的α-螺旋。在该裂隙中，肽抗原结合并以延伸的构象存在。HLAI和HLAII中的肽接触残基是大多数序列多态性的位置，其构成由不同HLA等位基因呈递的多种肽库的分子基本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种多组件系统，其中第一组件是工程化的抗原呈递细胞(eAPC)，称为组件A，第二组件是遗传供体载体，称为组件C，用于递送一个或多个编码分析物抗原‑呈递复合体(aAPX)和/或分析物抗原分子(aAM)的ORF，其中组件Aa.缺乏aAPX和/或aAM的至少一个家族的内源表面表达，和b.包含至少两个基因组接收位点，称为组件B和组件D，每个用于整合至少一个编码至少一个aAPX和/或aAM的ORF，并且组件C与组件B匹配，并且其中组件C被设计为递送c.单个编码至少一个aAPX和/或aAM的ORF，或d.两个或更多个编码至少一个aAPX和/或aAM的ORF，其中基因组接收位点B和D是设计用于重组酶介导的交换(RMCE)的合成构建体。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.11.07 DK PA2016708721.一种多组件系统，其中第一组件是工程化的抗原呈递细胞(eAPC)，称为组件A，第二组件是遗传供体载体，称为组件C，用于递送一个或多个编码分析物抗原-呈递复合体(aAPX)和/或分析物抗原分子(aAM)的ORF，其中组件Aa.缺乏aAPX和/或aAM的至少一个家族的内源表面表达，和b.包含至少两个基因组接收位点，称为组件B和组件D，每个用于整合至少一个编码至少一个aAPX和/或aAM的ORF，并且组件C与组件B匹配，并且其中组件C被设计为递送c.单个编码至少一个aAPX和/或aAM的ORF，或d.两个或更多个编码至少一个aAPX和/或aAM的ORF，其中基因组接收位点B和D是设计用于重组酶介导的交换(RMCE)的合成构建体。2.根据权利要求1的多组件系统，其中c和/或d任选地编码整合的选择标记，使得所述ORF能够稳定地整合到B基因组接收位点并且表达aAPX和/或aAM。3.根据权利要求1或2的多组件系统，其中称为E的另一组件是与D匹配的遗传载体，其中组件E被设计为递送a.单个编码至少一个aAPX和/或aAM的ORF，或b.两个或更多个编码至少一个aAPX和/或aAM的ORF并且其中a和/或b任选地编码整合的选择标记，使得所述ORF能够稳定整合到D基因组接收位点中，并且表达aAPX和/或aAM。4.根据前述权利要求中任一项的多组件系统，其中添加一个或多个另外的基因组接收位点和匹配的遗传供体载体作为系统的另外组件。5.根据前述权利要求中任一项的多组件系统，其中aAPX会是以下任何一种a.HLAI类的一个或多个成员b.HLAII类的一个或多个成员c.一个或多个非HLA抗原呈递复合体，或d.a，b和c的任意组合。6.根据前述权利要求中任一项的多组件系统，其中aAM选自a.作为分析物抗原提供的多肽或多肽复合体b.衍生自作为分析物抗原提供的多肽的肽c.作为分析物抗原提供的肽d.作为分析物抗原提供的代谢物e.从分析物抗原分子ORF翻译的多肽或多肽复合体f.衍生自从分析物抗原分子ORF翻译的多肽的肽g.衍生自改变组件A蛋白质组的肽h.衍生自改变组件A蛋白质组的多肽i.衍生自改变组件A代谢组的代谢物和/或其组合。7.根据前述权利要求中任一项的多组件系统，其中组件B和/或D包含至少一种下列遗传元件a.异种特异性重组酶位点b.同源臂c.真核启动子d.真核条件调控元件e.真核终止子f.选择标记g.剪接受体位点h.剪接供体位点i.非蛋白质编码基因j.绝缘子k.移动遗传元件l.大范围核酸酶识别位点m.内部核糖体进入位点(IRES)n.病毒自切割肽元件o.kozak共有序列。8.根据前述权利要求中任一项的多组件系统，其中组件B和/或D用于单个ORF的RMCE整合，并包含：a.真核启动子b.一对异种特异性重组酶位点c.Kozak共有序列d.选择标记e.真核终止子。9.根据权利要求3-8中任一项的多组件系统，其中存在组件E，并且组件C和/或E用于单个ORF的RMCE整合，并包含以下遗传元件：a.一对异种特异性重组酶位点b.Kozak共有序列c.抗生素抗性盒d.细菌的复制起点e.用于引入编码一个或多个aAPX和/或aAM和/或整合选择标记的单个ORF的克隆位点。10.根据权利要求3-9中任一项的多组件系统，其中组件C和/或E与至少一种编码至少一种aAPX和/或aAM的ORF组合以获得组件C'和/或E'。11.根据权利要求10的多组件系统，其中所述组合进行多次以获得组件C'和/或E'的库。12.根据权利要求10或11中任一项的多组件系统，其中一个或多个组件C'和/或E'与组件A组合，以将在组件C'和/或E'中编码的一个或多个aAPXORF整合到组件B和/或D中，以获得称为eAPC-p的细胞，其中组件B和/或D变成组件B'和/或D'，使得eAPC-p在细胞表面上表达aAPx。13.根据权利要求10或11中任一项的多组件系统，其中一个或多个组件C'和/或E'与组件A组合，以将在组件C'和/或E'中编码的一个或多个aAMORF整合到组件B和/或D中，以获得称为eAPC-a的细胞，其中组件B和/或D变成组件B'和/或D'，使得eAPC-a在细胞表面上或细胞内表达aAM。14.根据权利要求10或11中任一项的多组件系统，其中一个或多个组件C'和/或E'与组件A组合，以将在组件C'和/或E'中编码的一个或多个aAPXORF和/或一个或多个aAM整合到组件B和/或D中，以获得称为eAPC-pa的细胞，其中组件B和/或D变为组件B'和/或D'，使得eAPC-pa表达aAPX和aAM和/或aAPX:aAM。15.根据权利要求12的多组件系统，其中一个或多个组件C'或E'与eAPC-p组合，以将编码在组件C'或E'中的一个或多个aAMORF整合到组件B或D中，以获得称为eAPC-pa的细胞，其中组件B或D变为组件B'或D'，使得其表达aAPX和aAM和/或aAPX:aAM。16.根据权利要求13的多组件系统，其中一个或多个组件C'或E'与eAPC-a组合，以将编码在组件C'或E'中的一个或多个aAPXORF整合到组件B或D中，以获得称为eAPC-pa的细胞，其中组件B或D变为组件B'或D'，使得其表达aAPX和aAM和/或aAPX:aAM。17.如权利要求12定义的制备eAPC-p的方法，所述方法包括：a.将组件A与组件C'和/或E'中的至少一个组合，其中一个或多个组件C'和/或E'编码一个或多个aAPX，并与整合因子组合和至少一种b.选择基因组接收位点选择标记的丢失c.选择一个或多个aAPX的表面表达的获得d.选择一个或多个整合选择标记的获得。18.根据权利要求17的方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：R·M·贾维斯，R·E·希尔，L·B·帕塞，
申请(专利权)人：杰诺维有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞典,SE