一种T7RNA聚合酶和T7启动子的表达系统及使用其在真核生物中表达蛋白质的方法技术方案

本申请涉及一种T7 RNA聚合酶和T7启动子的表达系统及使用其在真核生物中表达蛋白质的方法。所述表达系统包含HIV‑1逆转录病毒中的Vpu蛋白和/或Rev‑RRE调控元件，该系统可使真核生物中T7转录的无5′cap结构的mRNA跨核膜运输到细胞质，从而实现连续稳定高效地表达外源蛋白。

【技术实现步骤摘要】
一种T7RNA聚合酶和T7启动子的表达系统及使用其在真核生物中表达蛋白质的方法
本申请涉及一种基于HIV-1的Vpu和Rev-RRE元件的T7RNA聚合酶(T7RNAP)和T7启动子表达系统，该表达系统可用于在真核细胞中持续稳定高效地表达蛋白。
技术介绍
T7表达系统已被广泛地应用于蛋白质的表达，其中在原核生物中的应用最为普遍(参见，专利文献1)。最典型的代表是Novagen公司研发的pET系列质粒，这类质粒目前已被广泛地应用在大肠杆菌中高效地表达蛋白质。对于真核生物，有研究者利用酵母菌株开展了T7表达系统的研究，但却没有得到积极的结果，只检测到T7RNAP的表达，没有检测到T7启动子控制的目的蛋白的合成(参见，非专利文献1和2)。还有研究者在哺乳动物细胞中以病毒(如牛痘病毒)作为载体构建存在于细胞质中的T7表达系统，存在于细胞质中的牛痘病毒载体会随着细胞分裂而丢失；同时，大量复制的牛痘病毒最终也会杀死宿主细胞。因此，该T7表达系统只能实现蛋白质在细胞质中的瞬时表达，难以实现持续稳定地表达目标蛋白(参见，非专利文献1和3)。为实现真核细胞内持续稳定地表达蛋白质，关键点在于将细胞核内转录后再加工的真核mRNA通过核膜成功转运至细胞质，然后才能实现mRNA在细胞质内翻译成蛋白质。但是，由于细胞核内T7RNAP转录出的mRNA没有5′帽子结构和3′poly(A)尾巴，不能被运输出细胞核，因此影响了细胞质内蛋白质的翻译合成，不能高效表达蛋白质。对于T7RNAP转录的缺乏5′cap结构的mRNA，有研究发现，在细胞质内利用IRES结构可以帮助缺乏5′cap结构的真核生物mRNA翻译合成蛋白质(参见，非专利文献4)，但是，该研究并未涉及细胞核内的T7RNAP转录的缺乏5′cap结构的mRNA运输到细胞质的问题。同样，还有研究表明，在T7启动子启动的转录单元中添加真核生物终止子序列可以帮助T7RNAP转录产物产生3′poly(A)尾巴(参见，非专利文献5)，但是该研究也未解决如何将缺乏5′cap结构的mRNA从细胞核运输到细胞质的问题。现有技术文献：专利文献1：CN102643851A非专利文献1：ELROY-STEINO,FUERSTTR,MOSSB.Cap-independenttranslationofmRNAconferredbyencephalomyocarditisvirus5'sequenceimprovestheperformanceofthevacciniavirus/bacteriophageT7hybridexpressionsystem[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,1989,86(16):6126-30.非专利文献2：BentonBM,EngW-K,DunnJJ,etal.Signal-mediatedimportofbacteriophageT7RNApolymeraseintotheSaccharomycescerevisiaenucleusandspecifictranscriptionoftargetgenes[J].MolecularandCellularBiology,1990,10(1):353-60.非专利文献3：WangW,LiY,WangY,etal.BacteriophageT7transcriptionsystem:anenablingtoolinsyntheticbiology[J].BiotechnologyAdvances,2018.非专利文献4：Elroy-SteinO,MossB.CytoplasmicexpressionsystembasedonconstitutivesynthesisofbacteriophageT7RNApolymeraseinmammaliancells[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,1990,87(17):6743-7.非专利文献5：KenDower,MichaelRosbash,T7RNApolymerase-directedtranscriptsareprocessedinyeastandlink3′endformationtomRNAnuclearexport[J].RNA,2002,8:686–697.
技术实现思路
专利技术要解决的问题本专利技术主要解决真核生物中T7表达系统转录的无5′cap结构的mRNA跨核膜运输到细胞质，连续稳定高效地表达重组蛋白的问题。用于解决问题的方案本专利技术人发现，人类免疫缺陷病毒(HIV-1)逆转录病毒基因组上存在编码Rev蛋白的基因，与Rev蛋白特异性结合的RNA称为Rev响应元件(Rev-responsiveelement，RRE)。Rev蛋白可以结合RRE，通过与剪接因子、剪接体相互作用抑制剪接，同时与核孔蛋白相互作用，将带有RRE的不完全剪接mRNA从细胞核运至细胞质。HIV-1逆转录病毒还编码小的调节蛋白，其中Vpu蛋白是由81个氨基酸寡聚形成的膜蛋白，折叠成两个不同的结构域，即N端跨膜疏水性结构域和C端细胞质结构域。由于具有该结构，Vpu蛋白以寡聚体形式穿入细胞膜形成通道，能够改善细胞膜的通透性。核定位信号(NuclearLocalizationSingal,NLS)通常为短的氨基酸序列，它能辅助目标蛋白进入细胞核，核定位信号的引入可以使蛋白进入细胞核。当在膜蛋白上游添加NLS，膜蛋白会定位在细胞核核膜上。本专利技术人基于以上事实，为解决T7表达系统转录mRNA跨核膜转运到细胞质的问题，提出如下两种设计方案：1)在T7表达系统中引入HIV-1逆转录病毒中的Rev-RRE调控元件，Rev蛋白可以特异性结合RRE序列，将带有RRE序列的缺乏5`cap结构T7RNAP转录的mRNA从细胞核运输至细胞质；2)在T7表达系统中引入带有核定位序列的vpu基因，使其蛋白定位在细胞核核膜上，从而改变核膜的通透性，使T7RNAP转录的产物通过渗透扩散进入细胞质。上述设计方案对于所适用的真核生物不进行特别限制，只要能实现T7RNAP转录的缺乏5′cap结构的mRNA跨核膜运输到细胞质即可。优选地，适用于酵母、哺乳动物、昆虫。更优选地，适用于酿酒酵母(Sachromycescerevisiae)、毕赤酵母(Pichiapastoris)、马克斯鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus)、仓鼠、人肾细胞、人Hela细胞、CHO、COS、BHK、SP2/0、NIH3T3、蚕、果蝇。最优选地，适用于酿酒酵母(Sachromycescerevisiae)和人Hela细胞。优选地，针对不同的真核生物可使用如下两种表达系统：(一)对于酵母，构建基于HIV-1的Vpu的T7表达系统。(二)对于哺乳动物，构建基于HIV-1的Vp本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种T7 RNA聚合酶和T7启动子的表达系统，其特征在于，所述表达系统包含HIV-1逆转录病毒中的Vpu蛋白和/或Rev-RRE调控元件。/n

【技术特征摘要】
1.一种T7RNA聚合酶和T7启动子的表达系统，其特征在于，所述表达系统包含HIV-1逆转录病毒中的Vpu蛋白和/或Rev-RRE调控元件。


2.根据权利要求1所述的表达系统，其特征在于，所述T7RNA聚合酶由SEQIDNo：1所表示的序列编码。


3.根据权利要求1或2所述的表达系统，其特征在于，所述T7RNA聚合酶的基因还含有核定位序列。


4.一种使用T7RNA聚合酶和T7启动子的表达系统在真核生物中表达蛋白质的方法，其特征在于，所述表达系统包含HIV-1逆转录病毒中的Vpu蛋白和/或Rev-RRE调控元件。


5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法包括：
1)合成所述带有核定位序列的T7RNA聚合酶基因序列，所述T7RNA聚合酶由SEQIDNo：1所表示的序列编码，将所述带有核定位序列的T7RNA聚合酶基因插入到整合型载体中；
2)将所述整合型载体线性化，回收线性化片段，转化到真核菌株中，通过抗性筛选得到基因组上整合了带有核定位序列的T7RNA聚合酶基因的真核重组菌株；
3)构建具有携带核定位序列的vpu基因的载体，以含有目标蛋白基因的质粒为模板扩增包含有T7启动子的目标蛋白DNA片段，回收所述包含有T7启动子的目标蛋白片段，将其插入具有前述携带核定位序列的vpu基因的载体中，得到含有所述vpu基因和目标蛋白基因的载体；和
4)将3)得到的所述载体转化到2)中的真核重组菌株中，构建基于HIV-1逆转录病毒中的Vpu蛋白的T7RNA聚合酶的表达系统。


6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法包括：
1)构建表达T7RNA聚合酶和Rev的载体，所述T7RNA聚合酶由SEQIDNo：1所表示的序列编码；
2)将含有T7启动子、T7终止子、IRES、RRE和目标蛋白基因的DNA片段转移至所述载体，构建能够表达T7RN...

【专利技术属性】
技术研发人员：王文雅，李君，李强，
申请(专利权)人：北京化工大学，
类型：发明
国别省市：北京;11