【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种制备肿瘤微环境响应电荷反转细胞内递送细胞色素c纳米胶囊的方法。
技术介绍
1、新兴的肿瘤免疫治疗是通过激活免疫系统，依靠人体自身免疫机能来遏制肿瘤的发展，最终清除肿瘤，为克服肿瘤的转移和复发带来了希望。目前为止，已有11种新的肿瘤免疫疗法获批，并逐渐改变着癌症治疗范式。不幸的是，在其他肿瘤中(包括晚期黑色素瘤、淋巴瘤等血液肿瘤)获得fda批准的抗pd-1在内的免疫检查点抑制剂对于其它实体瘤的治疗反应率低。治疗失败的主要的原因是免疫抑制肿瘤微环境(tme)限制了人体自身免疫细胞的浸润和活性，其特征包括效应t细胞的浸润差，骨髓炎症突出，癌细胞突变负担低，免疫原性抗原低等。因此，对肿瘤免疫抑制微环境进行重编程，将“冷肿瘤”转化为“热肿瘤”，是提高癌症免疫治疗疗效的关键。
2、临床前模型证明，解决tme的多重免疫脆弱性的联合疗法是提高免疫疗法响应率的有效策略。与免疫沉默的细胞凋亡不同，细胞焦亡以细胞膜破裂为特征，并伴随着诸多细胞因子和危险信号分子的释放，从而导致炎症反应并激活免疫系统。促进肿瘤细胞发生焦亡是一种提高免疫疗法响应率的有效策略。然而，目前经典的gsdme介导的细胞焦亡通常是由化疗药物诱导癌细胞中的caspase-3激活引起的，其耐药性和严重的副作用限制了其激活免疫的效果。细胞色素c(cyt c)介导的caspases激活是诱导细胞焦亡的新机制。cyt c是线粒体内的一种高度保守的电子转运蛋白，在正常情况下位于细胞的线粒体内膜和外膜之间。从线粒体释放到胞质的cyt c可形成凋亡体并激活caspas
3、然而，外源性的cyt c并不能被癌细胞摄取而发挥治疗性作用。此外，cyt c的体外稳定性差，体内血液循环半衰期短，这些都极大地限制了其在体内的应用。迄今为止，已经探索了各种脂质体、聚合物、无机纳米材料或蛋白质等药物载体用于促进治疗性蛋白质的靶向递送。虽然这些实例取得了一定的成功，但至今仍存在载体材料生物相容性差、生化修饰、包封的cyt c容易失活、稳定性差、递送效率低等问题。因此，开发探索安全智能、靶向性强、且能保持cyt c活性的药物载体，扩大治疗性蛋白的递送范围并推动治疗性蛋白疗法在临床治疗中的应用，具有重要的现实意义。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种制备肿瘤微环境响应电荷反转细胞内递送细胞色素c纳米胶囊的方法并诱导细胞焦亡激活免疫反应。
2、肿瘤微环境响应电荷反转细胞内递送细胞色素c纳米胶囊，其特征在于，在细胞色素c颗粒的外表面由单体和交联剂形成网络层进行包覆形成带正电荷的ncyt c，所述的单体包括丙烯酰胺(aam)和n-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺(apm)，所述的交联剂为n，n'-双(丙烯酰基)胱胺(bac)，在ncyt c外侧接枝乌头酸酐-peg链，所述的接枝为ncyt c外侧的叔胺基与乌头酸酐-peg链中的羧基发生反应形成酰胺基，最终形成中性的peg化细胞色素c纳米胶囊p-ncyt c即所述的纳米胶囊。
3、所述的肿瘤微环境响应电荷反转指的是所得到的中性纳米胶囊在肿瘤微环境的酸性条件下脱peg化再次形成正电性，即在肿瘤微环境的酸性ph下酰胺基断裂再形成正电性。进而能够增加被细胞的内化，并引发免疫反应。
4、所述的乌头酸酐-peg链为一端具有乌头酸酐基团的peg链(即乌头酸酐对peg的改性，为常规技术，很多商家可做)，peg的分子量为1000-10000如5000等。
5、上述所述的肿瘤微环境响应电荷反转细胞内递送细胞色素c纳米胶囊的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
6、(1)ncyt c的制备，在反应器中加入细胞色素c(cyt c)、单体和交联剂，所述的单体为丙烯酰胺(aam)和n-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺(apm)，所述的交联剂为n，n'-双(丙烯酰基)胱胺(bac)，cyt c:aam:apm:bac的摩尔比＝1：(3000-4000)：(500-700)：(300-500)优选1:3400:600:400；搅拌后加入引发剂过硫酸铵和n，n，n'，n'-四甲基乙二胺，过硫酸铵与cyt c摩尔比为1:400，过硫酸铵和n，n，n'，n'-四甲基乙二胺质量比为1:2，引发自由基原位聚合，在cyt c周围形成包封壳层，在冰浴中反应2小时，得到带正电细胞色素c纳米胶囊；
7、(2)p-ncyt c的制备，将edc、nhs、乌头酸酐-peg溶解在水溶液中，搅拌下反应一段时间如15min，随后逐滴加入ncyt c溶液，搅拌下反应至少10h如12h，反应结束后，在4℃下在pbs中透析过夜(mwco:30kda)，最后通过超滤(100kda)进行样品浓缩；其中ncyt c:乌头酸酐-peg:edc:nhs的摩尔比＝1:4000-5000:5000-7000：5000-7000优选1:3000:6000:6000。
8、本专利技术所得肿瘤微环境响应电荷反转细胞内递送细胞色素c纳米胶囊用于制备抗肿瘤、治疗肿瘤的药物，进一步用于制备引发癌细胞焦亡的药物；用于制备免疫疗法药物，进一步作为pd-1单克隆抗体(α-pd-1)的联合用药，用于制备免疫治疗药物，提高pd-1单克隆抗体(α-pd-1)的疗效。
9、本专利技术中所述的肿瘤为乳腺癌和肺转移的乳腺癌，该药物同样可以在黑色素瘤、肺癌、肝癌等肿瘤类型中进行应用。
10、本专利技术采用原位聚合的方法，利用细胞色素c的表面电荷和疏水作用力，使单体和交联剂在蛋白周围聚合，形成交联网络将蛋白包裹起来，避免直接对蛋白进行改性，且大大增加了蛋白的体内循环时间。单体选择丙烯酰胺(aam)和n-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺(apm)，apm末端为伯胺基团，为纳米胶囊壳提供正电荷和反应位点。交联剂选择n，n'-双(丙烯酰基)胱胺(bac)，该交联剂含有二硫键基团(-s-s-)，能够响应谷胱甘肽(gsh)断裂，而肿瘤细胞由于提高的氧化还原水平，细胞内具有高浓度的gsh(1-10mm)，从而实验纳米胶囊在肿瘤细胞内的货物释放。由此得到的纳米胶囊命名为ncyt c，具有正电荷。然而直接体内注射正电荷材料ncyt c，容易被巨噬细胞捕获清除，且具有全细胞毒性，生物安全性差。因此，我们在ncyt c表面接枝乌头酸酐-peg链(命名为p-ncyt c)，以屏蔽正电荷，增加材料在人体内的循环和肿瘤的靶向。乌头酸酐-peg链是一端具有乌头酸酐基团的peg链，乌头酸酐基团能够在edc/nhs的活化下，与ncyt c表面的叔胺基团发生反应，形成酰胺基团，该酰胺基团具有在酸性本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种肿瘤微环境响应电荷反转细胞内递送细胞色素C纳米胶囊，其特征在于，在细胞色素C颗粒的外表面由单体和交联剂形成网络层进行包覆形成带正电荷的nCyt C，所述的单体包括丙烯酰胺(AAM)和N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺(APm)，所述的交联剂为N，N'-双(丙烯酰基)胱胺(BAC)，在nCyt C外侧接枝乌头酸酐-PEG链，所述的接枝为nCyt C外侧的叔胺基与乌头酸酐-PEG链中的羧基发生反应形成酰胺基，最终形成中性的PEG化细胞色素C纳米胶囊P-nCyt C即所述的纳米胶囊。
2.按照权利要求1所述的纳米胶囊，其特征在于，所述的肿瘤微环境响应电荷反转指的是所得到的中性纳米胶囊在肿瘤微环境的酸性条件下脱PEG化再次形成正电性，即在肿瘤微环境的酸性pH下酰胺基断裂再形成正电性。
3.按照权利要求1所述的纳米胶囊，其特征在于，所述的乌头酸酐-PEG链为一端具有乌头酸酐基团的PEG链，PEG的分子量为1000-10000如5000等。
4.权利要求1-3任一项所述的肿瘤微环境响应电荷反转细胞内递送细胞色素C纳米胶囊的制备方法，其特征在于，包括以
5.按照权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，Cyt c:AAM:APM:BAC的摩尔比＝1：(3000-4000)：(500-700)：(300-500)优选1:3400:600:400；过硫酸铵与Cyt C摩尔比为1:400，过硫酸铵和N，N，N'，N'-四甲基乙二胺质量比为1:2。
6.按照权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(2)中其中nCyt C:乌头酸酐-PEG:EDC:NHS的摩尔比＝1:4000-5000:5000-7000：5000-7000优选1:3000:6000:6000。
7.权利要求1-3任一项所述的肿瘤微环境响应电荷反转细胞内递送细胞色素C纳米胶囊用于制备抗肿瘤、治疗肿瘤的药物。
8.权利要求1-3任一项所述的肿瘤微环境响应电荷反转细胞内递送细胞色素C纳米胶囊用于制备引发癌细胞焦亡的药物。
9.权利要求1-3任一项所述的肿瘤微环境响应电荷反转细胞内递送细胞色素C纳米胶囊用于制备免疫疗法药物，进一步作为PD-1单克隆抗体(α-PD-1)的联合用药，用于制备免疫治疗药物，提高PD-1单克隆抗体(α-PD-1)的疗效。
...【技术特征摘要】
1.一种肿瘤微环境响应电荷反转细胞内递送细胞色素c纳米胶囊，其特征在于，在细胞色素c颗粒的外表面由单体和交联剂形成网络层进行包覆形成带正电荷的ncyt c，所述的单体包括丙烯酰胺(aam)和n-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺(apm)，所述的交联剂为n，n'-双(丙烯酰基)胱胺(bac)，在ncyt c外侧接枝乌头酸酐-peg链，所述的接枝为ncyt c外侧的叔胺基与乌头酸酐-peg链中的羧基发生反应形成酰胺基，最终形成中性的peg化细胞色素c纳米胶囊p-ncyt c即所述的纳米胶囊。
2.按照权利要求1所述的纳米胶囊，其特征在于，所述的肿瘤微环境响应电荷反转指的是所得到的中性纳米胶囊在肿瘤微环境的酸性条件下脱peg化再次形成正电性，即在肿瘤微环境的酸性ph下酰胺基断裂再形成正电性。
3.按照权利要求1所述的纳米胶囊，其特征在于，所述的乌头酸酐-peg链为一端具有乌头酸酐基团的peg链，peg的分子量为1000-10000如5000等。
4.权利要求1-3任一项所述的肿瘤微环境响应电荷反转细胞内递送细胞色素c纳米胶囊的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
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