通过发酵生产4-氨基苯乙胺的工程化生物合成途径制造技术

本公开描述了用于发酵生产4

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】通过发酵生产4
‑
氨基苯乙胺的工程化生物合成途径
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2020年8月20日提交的美国临时申请号63/068,323的权益，其全部内容通过引用并入本文。
[0003]关于在联邦资助的研究和开发下进行的专利技术的权利的声明
[0004]不适用。
[0005]通过引用并入序列表
[0006]本申请包括已经以ASCII格式电子提交的序列表，其全部内容通过引用并入本文。这个ASCII拷贝是在2021年的8月19日创建的，命名为ZMGNP043WO_SeqList_ST25.txt，大小为448,733字节。


[0007]概括地说，本公开涉及通过发酵生产4
‑
氨基苯乙胺的工程化微生物领域。

技术介绍

[0008]4‑
氨基苯乙胺(4
‑
APEA)是芳族胺(AA)。AA用于生产先进的聚合物材料，包括功能性和/或高性能塑料。AA的胺基和芳族部分分别提供亲核反应性和优异的热机械性能。AA通常与羰基化合物缩聚以产生芳族聚酰胺、聚酰亚胺、聚唑、聚脲和聚甲亚胺。AA与芳族酸的缩聚产生具有极高热机械性能的超工程塑料。这些包括聚(对苯二甲酰对苯二胺(KEVLAR
TM
)和聚(4,4'
‑
氧二亚苯基均苯四甲酰亚胺)(KAPTON
TM
)，它们用作防弹衣和其他阻燃材料的织物中的热稳定材料，用于电子设备、车身和抗压气缸的纤维增强塑料。/>[0009]已经在大肠杆菌(Escherichia coli)中证明了4
‑
APEA的发酵生产(Masuo等人,(2016)Scientific Reports,6:25764)，但是大肠杆菌(E.coli)对高滴度4
‑
APEA的耐受性差使其不适合大规模发酵宿主。

技术实现思路

[0010]本公开提供了工程化的微生物细胞、微生物细胞的培养物以及生产4
‑
氨基苯乙胺(4
‑
APEA)的方法，包括以下：
[0011]本文所关注的各种实施方案可以包括但不必限于以下的一个或多个：
[0012]实施方案1：产生4
‑
氨基苯乙胺(4
‑
APEA)的工程化微生物细胞，其中该工程化微生物细胞对与产生4
‑
APEA相关的毒性具有高耐受性，该耐受性由工程化微生物细胞的生长减慢至少30克/升的一半(Ki)的浓度来定义。
[0013]实施方案2：实施方案1的工程化微生物细胞，其中该工程化微生物细胞包括真菌细胞。
[0014]实施方案3：实施方案2的工程化微生物细胞，其中该工程化微生物细胞包括酵母细胞。
[0015]实施方案4：实施方案3的工程化微生物细胞，其中酵母细胞是Komagataella属的
细胞。
[0016]实施方案5：实施方案4的工程化微生物细胞，其中酵母细胞是pastoris或phaffi种的细胞。
[0017]实施方案6：实施方案1
‑
5中任一项的工程化微生物细胞，其中随着4
‑
APEA浓度的增加，观察到的毒性效应的斜率小于6。
[0018]实施方案7：实施方案1
‑
6中任一项的工程化微生物细胞，其中该工程化微生物细胞异源表达以下酶活性中的每一种：4
‑
氨基
‑4‑
脱氧分支酸合酶、4
‑
氨基
‑4‑
脱氧分支酸变位酶、4
‑
氨基
‑4‑
脱氧预苯酸脱氢酶、氨基转移酶(AT)和脱羧酶(DC)，其中这些酶活性由编码这些酶的异源表达基因提供，并且至少一种异源表达的酶对于该工程化微生物细胞是非天然的。
[0019]实施方案8：实施方案7的工程化微生物细胞，其中至少两种、三种、四种或所有异源表达的酶对于工程化微生物细胞是非天然的。
[0020]实施方案9：产生4
‑
氨基苯丙酮酸(4
‑
APP)的Komagataella属的工程化微生物细胞。
[0021]实施方案10：实施方案9的工程化微生物细胞，其中该工程化微生物细胞是pastoris或phaffi种的细胞。
[0022]实施方案11：实施方案9或实施方案10的工程化微生物细胞，其中该工程化微生物细胞异源表达以下酶活性中的每一种：4
‑
氨基
‑4‑
脱氧分支酸合酶、4
‑
氨基
‑4‑
脱氧分支酸变位酶和4
‑
氨基
‑4‑
脱氧预苯酸脱氢酶，其中每种酶活性由编码这些酶的异源表达基因提供，并且至少一种异源表达的酶对于工程化微生物细胞是非天然的。
[0023]实施方案12：实施方案9
‑
11中任一项的工程化微生物细胞，其中该工程化微生物细胞还产生4
‑
氨基苯丙氨酸(4
‑
APhe)。
[0024]实施方案13：实施方案12的工程化微生物细胞，其中该工程化微生物细胞还异源表达氨基转移酶(AT)活性。
[0025]实施方案14：实施方案9
‑
11中任一项的工程化微生物细胞，其中该工程化微生物细胞还产生4
‑
氨基苯乙醇。
[0026]实施方案15：实施方案14的工程化微生物细胞，其中该工程化微生物细胞还异源表达醇脱氢酶/乙醛还原酶。
[0027]实施方案16：实施方案9
‑
15中任一项的工程化微生物细胞，其中至少两种、三种或所有异源表达的酶对于工程化微生物细胞是非天然的。
[0028]实施方案17：实施方案7
‑
16中任一项的工程化微生物细胞，其中至少一种异源表达的酶由组成型启动子表达。
[0029]实施方案18：实施方案7
‑
16中任一项的工程化微生物细胞，其中异源表达的酶中的至少一种由受调控的启动子表达，任选地其中该受调控的启动子是硫胺素阻遏型启动子。
[0030]实施方案19：实施方案1
‑
18中任一项的工程化微生物细胞，其中该工程化微生物细胞包含增加的活性的一种或多种上游分支酸途径酶，所述增加的活性为相对于对照细胞是增加的。
[0031]实施方案20：实施方案19的工程化微生物细胞，其中所述增加的活性选自葡糖激
酶、转酮醇酶、转醛醇酶、磷酸
‑2‑
脱氢
‑3‑
脱氧庚糖酸醛缩酶、3
‑
脱氧
‑
D
‑
阿拉伯
‑
庚酮糖酸
‑7‑
磷酸(DAHP)合酶、3
‑
脱氢奎尼酸合酶、3
‑
脱氢奎本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种产生4
‑
氨基苯乙胺(4
‑
APEA)的工程化微生物细胞，其中所述工程化微生物细胞对与4
‑
APEA的产生相关的毒性具有高耐受性，所述高耐受性由工程化微生物细胞的生长减慢至少30克/升的一半(Ki)的浓度定义，其中所述工程化微生物细胞任选地包含酵母细胞，任选地Komagataella属的细胞，任选地其中所述酵母细胞是pastoris或phaffi种的细胞。2.权利要求1所述的工程化微生物细胞，其中所述工程化微生物细胞异源表达以下酶活性中的每一种：4
‑
氨基
‑4‑
脱氧分支酸合酶；4
‑
氨基
‑4‑
脱氧分支酸变位酶；4
‑
氨基
‑4‑
脱氧预苯酸脱氢酶；氨基转移酶(AT)；以及脱羧酶(DC)；其中所述酶活性由异源表达编码所述酶的基因提供，并且至少一种异源表达的酶对于所述工程化微生物细胞是非天然的，任选地其中所述异源表达的酶中的至少两种、三种、四种或全部对于所述工程化微生物细胞是非天然的。3.一种产生4
‑
氨基苯丙酮酸(4
‑
APP)的Komagataella属的工程化微生物细胞，任选地其中所述工程化微生物细胞是pastoris或phaffi种的细胞。4.权利要求3所述的工程化微生物细胞，其中所述工程化微生物细胞异源表达以下酶活性中的每一种：4
‑
氨基
‑4‑
脱氧分支酸合酶；4
‑
氨基
‑4‑
脱氧分支酸变位酶；以及4
‑
氨基
‑4‑
脱氧预苯酸脱氢酶，其中每种酶活性由异源表达编码所述酶的基因提供，并且至少一种异源表达的酶对于所述工程化微生物细胞是非天然的。5.权利要求3
‑
4中任一项所述的工程化微生物细胞，其中所述工程化微生物细胞还产生4
‑
氨基苯丙氨酸(4
‑
APhe)。6.权利要求5所述的工程化微生物细胞，其中所述工程化微生物细胞还异源表达氨基转移酶(AT)活性。7.权利要求3
‑
4中任一项所述的工程化微生物细胞，其中所述工程化微生物细胞还产生4
‑
氨基苯乙醇。8.权利要求7所述的工程化微生物细胞，其中所述工程化微生物细胞还异源表达醇脱氢酶/乙醛还原酶。9.权利要求3
‑
8中任一项所述的工程化微生物细胞，其中所述异源表达的酶中的至少两种、三种或全部对于所述工程化微生物细胞是非天然的。10.权利要求1
‑
9中任一项所述的工程化微生物细胞，其中所述工程化微生物细胞包含增加的活性的一种或多种上游分支酸途径酶，所述增加的活性为相对于对照细胞是增加的，任选地其中所述增加的活性选自葡糖激酶、转酮醇酶、转醛醇酶、磷酸
‑2‑
脱氢
‑3‑
脱氧庚糖酸醛缩酶、3
‑
脱氧
‑
D
‑
阿拉伯
‑
庚酮糖酸
‑7‑
磷酸(DAHP)合酶、3
‑
脱氢奎尼酸合酶、3
‑
脱氢奎尼酸脱水酶、莽草酸脱氢酶、莽草酸激酶、3
‑
磷酸莽草酸1
‑
羧基乙烯基转移酶、分支酸合酶活性及其任何组合。
11.权利要求1
‑
10中任一项所述的工程化微生物细胞，其中所述工程化微生物细胞包含增加的活性的一种或多种氮同化和利用途径酶，任选地其中所述增加的活性选自异柠檬酸脱氢酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸合成酶、谷氨酸脱氢酶、铵通透酶及其任何组合。12.权利要求1
‑
11中任一项所述的工程化微生物细胞，其中所述工程化微生物细胞包含降低的活性的消耗一种或多种分支酸途径前体、分支酸、和/或一种或多种由分支酸至4
‑
APEA的途径中的中间体的一种或多种酶，和/或消耗4
‑
APEA的多种酶，所述降低的活性为相对于对照细胞是降低的，任选地其中消耗一种或多种分支酸途径前体的一种或多种酶选自二羟丙酮磷酸酶、3
‑
脱氢莽草酸脱水酶、莽草酸脱氢酶和磷酸烯醇丙酮酸磷酸转移酶，任选地其中消耗分支酸的一种或多种酶选自邻氨基苯甲酸合酶和分支酸变位酶，任选地其中消耗一种或多种由分支酸至4
‑
APEA的途径中的中间体的一种或多种酶选自脱羧酶、芳香族氨基酸脱羧酶、苯丙酮酸脱羧酶、丙酮酸脱羧酶、芳香族氨基酸解氨酶和醇脱氢酶/乙醛还原酶，任选地其中消耗4
‑
APEA的一种或多种酶选自苯丙酮酸双加氧酶、二胺氧化酶、胺氧化酶和氨基酸氧化酶。13.权利要求1
‑
12中任一项所述的工程化微生物细胞，其中所述工程化微生物细胞还表达反馈去调节的DAHP合酶。14.权利要求1
‑
13中任一项所述的工程化微生物细胞，其中所述工程化微生物细胞包含增加的活性的增加还原形式的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)供应的一种或多种酶，所述增加的活性为相对于对照细胞是增加的，任选地其中增加还原形式的NADPH供应的一种或多种酶选自戊糖磷酸途径酶、NADP+依赖性甘油醛3
‑
磷酸脱氢酶(GAPDH)和NADP+依赖性谷氨酸脱氢酶。15.权利要求1所述的工程化微生物细胞，其中所述非天然酶包括：与来自荧光假单胞菌(菌株SBW25)的4
‑
氨基
‑4‑
脱氧分支酸合酶具有至少70％氨基酸序列同一性的4
‑
氨基
‑4‑
脱氧分支酸合酶；与来自Photorhabdus laumondii亚种laumondii(菌株DSM 15139/CIP 105565/TT01)的4
‑
氨基
‑4‑
脱氧分支酸变位酶具有至少70％氨基酸序列同一性的4
‑
氨基
‑4‑
脱氧分支酸变位酶；与来自荧光假单胞菌(菌株SBW25)的4
‑
氨基
‑4‑
脱氧预苯酸脱氢酶具有至少70％氨基酸序列同一性的4
‑
氨基
‑4‑
脱氧预苯酸脱氢酶；任选地，与来自...

【专利技术属性】
技术研发人员：郝璋颖，S，
申请(专利权)人：齐默尔根公司，
类型：发明
国别省市：