一种无细胞催化合成亚精胺的生物方法技术

本发明专利技术提供了一种无细胞催化亚精胺合成的生物方法，属于酶与酶工程领域。具体包括如下酶：天冬氨酸激酶、天冬氨酸

【技术实现步骤摘要】
一种无细胞催化合成亚精胺的生物方法


[0001]本专利技术涉及一种生物法合成亚精胺的方法，属于生物工程


技术介绍

[0002]亚精胺(Spermidine)是一种天然多功能多胺，存在于所有生物中，是一种重要的生理活性物质。医学上，亚精胺具有延长动物寿命的功效，并抵消与年龄相关的疾病，如心血管疾病，神经退行性疾病和癌症等。农业上，植物和微生物的生理过程中起关键作用的重要内源性调节剂,可以提高果实产量与质量。
[0003]生物体中主要有两种途径合成亚精胺(如图1)：一是脱羧S
‑
腺苷甲硫氨酸与腐胺在亚精胺合成酶的作用下合成亚精胺，该途径涉及腺苷甲硫氨酸合成酶、S
‑
腺苷甲硫氨酸脱羧酶、亚精胺合成酶。腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)的作用是催化甲硫氨酸合成S
‑
腺苷甲硫氨酸，S
‑
腺苷甲硫氨酸脱羧酶(SAMDC)的作用是催化S
‑
腺苷甲硫氨酸脱羧生成脱羧S
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腺苷甲硫氨酸，亚精胺合成酶(SRM)的作用是转移脱羧S
‑
腺苷甲硫氨酸的氨基丙基到丁二胺上形成亚精胺，但途径中涉及的底物SAM价格昂贵，产业化难度高；二是天冬氨酸
‑
β
‑
半醛和腐胺在羧基亚精胺脱氢酶(CasDH)和羧基亚精胺脱羧酶(CasDC)的催化下合成亚精胺，该途径涉及天冬氨酸激酶(AK)、天冬氨酸
‑
β
‑
半醛脱氢酶(ASADH)、CasDH和CasDH。天冬氨酸经AK的催化作用生产天冬氨酸
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β
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磷酸，天冬氨酸
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β
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磷酸在ASADH的催化作用下生成天冬氨酸
‑
β
‑
半醛，CasDH将其与腐胺催化生成羧基亚精胺，最后在CasDC的催化作用下生产亚精胺，因底物天冬氨酸的价格低廉，是一种新的替代合成途径。
[0004]然而，在方法二中，天冬氨酸经AK催化合成天冬氨酸磷酸反应过程的吉布斯自由能小于零(
‑
2.2kJ/mol)，天冬氨酸磷酸经ASADH催化形成天冬氨酸
‑
β
‑
半醛反应过程的吉布斯自由能小于零(
‑
7.1kJ/mol)，导致二者的转化率低，这两个限速步骤仍是当前亟需解决的关键难题。

技术实现思路

[0005]本专利技术通过高通量筛选得到AK和天冬氨酸
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β
‑
半醛脱氢酶的突变株，通过过表达天冬氨酸与腐胺合成亚精胺途径中的四种关键酶，使其以天冬氨酸与腐胺为底物来实现亚精胺的高效生产。
[0006]技术方案
[0007]本专利技术提供了一种无细胞催化合成亚精胺的生物方法，是以天冬氨酸与腐胺为底物合成亚精胺，天冬氨酸被天冬氨酸激酶以ATP为辅酶催化生成天冬氨酸
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β
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磷酸和ADP，天冬氨酸
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β
‑
磷酸被天冬氨酸
‑
β
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半醛脱氢酶以NADPH或NADP为辅酶催化生成天冬氨酸
‑
β
‑
半醛和NADP(NAD)；羧基亚精胺脱氢酶以NADPH或NADP为辅酶将天冬氨酸
‑
β
‑
半醛和腐胺合成酶羧基亚精胺，辅酶再生为NADP(NAD),最后羧基亚精胺脱羧酶将羧基亚精胺脱羧生成亚精胺；在以上过程中，由多聚磷酸盐激酶实现ATP的再生、由葡萄糖脱氢酶实现NADPH(NADP)的再生。
[0008]所述天冬氨酸激酶来源于萎缩芽孢杆菌NX
‑
12，其氨基酸序列如SEQ.1所示。经突变筛选后，天冬氨酸激酶突变体酶活达到228.5U/mg，转化率达98.8％。天冬氨酸激酶突变体(命名为Aspkinase
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M)，其氨基酸序列如SEQ.2所示，包含以下差别：
[0009]将如SEQ ID No.1所示氨基酸序列的第34位精氨酸替换为天冬氨酸，第68位酪氨酸替换为亮氨酸，第121位丙氨酸替换为精氨酸，220位谷氨酸替换为精氨酸，第333位精氨酸替换为天冬氨酸。
[0010]所述的天冬氨酸
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β
‑
半醛脱氢酶来源于萎缩芽孢杆菌NX
‑
12，其氨基酸序列如SEQ.3所示。经突变筛选后，天冬氨酸
‑
β
‑
半醛脱氢酶突变体酶活达到89.2U/mg，转化率达95.6％。天冬氨酸
‑
β
‑
半醛脱氢酶突变体(重新命名为EcAsen
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M)，所述的氨基酸序列如SEQ.4所示，包含以下差别：
[0011]将如SEQ ID No.3所示氨基酸序列的第28位丙氨酸替换为天冬氨酸，第75位苯丙氨酸替换为甘氨酸，第155位天冬酰胺替换为色氨酸，第223位赖氨酸替换为丙氨酸，第235位组氨酸替换为天冬氨酸，第356位苏氨酸替换为丙氨酸。
[0012]所述羧基亚精胺脱氢酶可以来自于Porphyromonas catoniae ATCC 51270、Porphyromonas crevioricanisATCC 33277、Runella slithyformis DSM 19594或Porphyromonas gingivalis ATCC 33277。所述羧基亚精胺脱氢酶的氨基酸序列可以是NCBI上Accession NO.为LS483447.1、CP002859.1、ERJ96771.1或ERI79986.l的序列。编码所述羧基亚精胺脱氢酶的基因的核苷酸序列可以是NCBI上Accession NO.为CP072333REGION:566074...3567270、CP025931REGION:466768...467985或CP011996REGION:1326074
…
1327291的序列。
[0013]所述羧基亚精胺脱羧酶可以来自于Butyrivibrio crossotus strain DSM 2876，Eubacterium eligens ATCC 27750或Ruminococcus gauvreauii strain DSM 19829。所述羧基亚精胺脱羧酶的氨基酸序列可以是NCBI上Accession NO.为CP102270.1，CP001104.1，CP102290.1的序列。编码所述羧基亚精胺脱氢酶的基因的核苷酸序列可以是NCBI上Accession NO.为CP102270REGION264434
…
265564,CP001104REGION 1476074
…
1477300或CP102267REGION450849
…
451970的序列。
[0014]本专利技术通过Spy
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种无细胞催化亚精胺的生物合成方法，其特征在于，以L
‑
天冬氨酸和腐胺盐酸盐为底物合成亚精胺，L
‑
天冬氨酸通过天冬氨酸激酶突变体催化形成L
‑
天冬氨酸
‑4‑
磷酸；L
‑
天冬氨酸
‑4‑
磷酸被天冬氨酸
‑
β
‑
半醛脱氢酶突变体催化形成L
‑
天冬氨酸
‑
β
‑
半醛；L
‑
天冬氨酸
‑
β
‑
半醛和腐胺盐酸盐被羧基亚精胺脱氢酶催化形成羧基亚精胺；最终羧基亚精胺被羧基亚精胺脱羧酶催化形成亚精胺；其中，所述天冬氨酸激酶突变体是在来源于萎缩芽孢杆菌NX
‑
12的氨基酸序列如Seq.1所示的天冬氨酸激酶经突变筛选后得到的，其氨基酸序列如Seq.2所示；所述天冬氨酸
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β
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半醛脱氢酶突变体是在来源于萎缩芽孢杆菌NX
‑
12的氨基酸序列如Seq.3所示的天冬氨酸
‑
β
‑
半醛脱氢酶经突变筛选后得到的，其氨基酸序列如Seq.4所示。2.根据权利要求1所述的一种无细胞催化亚精胺的生物合成方法，其特征在于，通过Spy
‑
Tag和Spy
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Catcher分别实现天冬氨酸激酶突变体与多聚磷酸盐激酶、天冬氨酸
‑
β
‑
半醛脱氢酶突变体与葡萄糖脱氢酶、羧基亚精胺脱氢酶与葡萄糖脱氢酶的共表达。3.根据权利要求1所述的一种无细胞催化亚精胺的生物合成方法，其特征在于，合成体系包括：复合多酶体系1
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1000mg/L，L
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天冬氨酸0.01
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100g/L，腐胺0.01
‑
100g/L，葡萄糖0....

【专利技术属性】
技术研发人员：孙良，李振，徐虹，雷鹏，王瑞，谷益安，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：