【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物工程，具体涉及一种生产1,3-丁二醇的同工酶共表达重组菌及其构建方法和应用。
技术介绍
1、1,3-丁二醇(1,3-bdo)是一种重要的c4平台化学品，它是一种无色、透明、粘稠的液体，带有淡淡的水果香气，由于其毒性极小、保湿性强、抗菌性能和水溶性优异，该化合物被广泛用作在化妆品中的溶剂，并且由于其具有良好的生物相容性，也是合成香料、信息素和药物等工业化学品的关键中间体。全球1,3-bdo市场预计将以5.8％的复合年增长率增长，预计到2030年全球1,3-bdo市场将达到2.701亿美元。目前，1,3-bdo传统的生产工艺主要依赖化石原料，采用高浓度的乙醛缩合加氢，但是此工艺同时也会发生多级醛缩反应，从而导致产率下降且伴有污染性的副产物，近年来，随着全球化资源日渐枯竭，寻找可再生替代资源成为当务之急，研究生物法生产1,3-丁二醇的工作受到越来越多的关注。
2、对于自然界中不能天然合成的化学品来说，则需要构建人工合成路径进行合成。在异源宿主中构建相关化学品的代谢路径时，通常，会从众多的同工酶中去优选其中一种比较好的。很少有研究考虑把不同来源的同工酶进行组合来共表达。在生物合成途径的组装中，一个代谢路径上有很多个酶，这些途径酶之间可能存在匹配性，虽然是同工酶，但是不同的同工酶跟上下游之间酶的匹配效果往往不同，因此，并不能确定在代谢路径中引入任意两种以上的同工酶会有好的效果。例如：大肠杆菌具有将3-羟基丁醛(3-hba)还原为1,3-丁二醇(1,3-bdo)的天然醇脱氢酶，由于醇脱氢酶是1,3-bdo合成途
技术实现思路
1、专利技术目的：本专利技术所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种生产1,3-丁二醇的同工酶共表达重组菌及其构建方法和应用。
2、为了解决上述技术问题，本专利技术公开了一种生产1,3-丁二醇的同工酶共表达重组菌及其构建方法和应用。具体技术方案如下：
3、第一方面，本专利技术提供了一种生产1,3-丁二醇的同工酶共表达重组菌，所述重组菌同时表达了bld、ald和adhe2中任意2个或2个以上的酶；所述的bld为来源于糖霜梭菌clostridium saccharoperbutylacetonicum的bld基因编码的醛脱氢酶；所述的ald为来源于拜氏梭菌clostridium beijerinckii的ald基因编码的醛脱氢酶同工酶；所述的adhe2为来源于丙酮丁醇梭菌clostridium acetobutylicum的adhe2基因编码的醛醇脱氢酶同工酶(双功能酶)。通过再次过表达代谢路径上所需酶的同工酶，来提高细胞内乙酰辅酶a流向1,3-丁二醇合成途径的代谢通量。
4、优选地，所述的重组菌同时表达了bld和adhe2，或者，同时表达了bld和ald。
5、其中，所述的重组菌还表达了thl、atob和phaa中的任意一个或多个组合的酶；所述的thl为来源于丙酮丁醇梭菌clostridium acetobutylicum的thl基因编码的硫解酶；所述的atob为来源于大肠杆菌escherichia coli的atob基因编码的硫解酶同工酶；所述的phaa为来源于钩虫贪铜菌cupriavidus necator的phaa基因编码的硫解酶同工酶。
6、其中，所述的重组菌还表达了phab，所述的phab为来源于钩虫贪铜菌的phab基因编码的乙酰乙酰辅酶a脱氢酶。
7、其中，优选地，所述的重组菌同时表达了bld、adhe2、thl和phab，或者，同时表达了bld、ald、thl和phab，更优选地是所述的重组菌同时表达了bld、adhe2、thl和phab。
8、其中，所述的thl，phab，bld，phaa，atob，ald和adhe2基因的核苷酸序列分别顺序对应于seq id no.1-7所示的核苷酸序列。
9、其中，所述的重组菌，其出发菌株为埃希氏菌属(escherichia)，优选大肠杆菌，更优选大肠杆菌bl21(de3)。
10、本专利技术的第二方面在于，还提供了一种第一方面所述的重组菌的构建方法，即扩增bld、adhe2和ald中任意2个或2个以上的基因，构建重组载体，导入出发菌株，得到重组菌。
11、其中，所述构建方法具体包括如下步骤：
12、(1)扩增thl、phab和bld基因，并以rbs连接，将三个基因克隆至第一质粒载体中，得到第一重组载体；
13、(2)将第一重组载体导入出发菌株，得到第一重组菌株；
14、(3)分别扩增ald和/或adhe2基因，同时分别扩增phaa和/或atob，将扩增的基因克隆至第二质粒载体中，得到第二重组载体；
15、(4)将第二重组载体导入第一重组菌株，即得。
16、其中，所述的第一质粒载体为pacycduet-1、petduet-1、pcdfduet-1、prsfduet-1或pcoladuet-1中的任意一个；所述的第二质粒载体为能与第一质粒载体共存的质粒，优选pet28a、pet23a、pet30a或pet29a中的任意一种。
17、优选的构建方法如下，(1)扩增thl、phab和bld基因，以扩增下来的thl基因和phab基因为模板，进行overlap，两个基因之间以rbs连接，将扩增下来的thl+phab克隆到pcdfduet-1载体的sal i和not i酶切位点间，得到中间重组载体pcdfduet-1(thl+phab)；以pcdfduet-1(thl+phab)为基础，将扩增下来的bld基因克隆到nde i和xho i酶切位点间，得到第一重组载体pcdfduet-1(thl+phab-bld)。
18、(2)将第一重组载体导入出发菌株大肠杆菌bl21(de3)中，得到第一重组菌株：e.coli bl21(de3)/pcd本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种生产1,3-丁二醇的同工酶共表达重组菌，其特征在于，所述重组菌同时表达了Bld、Ald和AdhE2中任意2个或2个以上的酶；
2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌同时表达了Bld和Ald，或者，同时表达了Bld和AdhE2。
3.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述的重组菌表达了Thl、AtoB和PhaA中的任意一个或多个组合的酶；
4.根据权利要求3所述的重组菌，其特征在于，所述的重组菌表达了PhaB，所述的PhaB为来源于钩虫贪铜菌的phaB基因编码的乙酰乙酰辅酶A脱氢酶。
5.根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于，所述的重组菌同时表达了Bld、AdhE2、Thl和PhaB，或者，同时表达了Bld、Ald、Thl和PhaB，优选地是所述的重组菌同时表达了Bld、AdhE2、Thl和PhaB。
6.根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于，所述的thl、phaB、bld、phaA、atoB、ald和adhE2基因的核苷酸序列分别顺序对应于SEQ ID NO.1-7所示的核苷酸序列。p>
7.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述的重组菌，其出发菌株为埃希氏菌属Escherichia，优选大肠杆菌。
8.权利要求1或2所述的重组菌的构建方法，其特征在于，扩增bld、adhE2和ald中任意2个或2个以上的基因，构建重组载体，导入出发菌株，得到重组菌。
9.根据权利要求8所述的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
10.根据权利要求9所述的构建方法，其特征在于，所述的第一质粒载体为pACYCDuet-1、pETDuet-1、pCDFDuet-1、pRSFDuet-1或pCOLADuet-1中的任意一种；所述的第二质粒载体为能与第一质粒载体共存的质粒，优选pET28a、pET23a、pET30a或pET29a中的任意一种。
11.权利要求1-7中任意一项所述的重组菌在发酵生产1,3-丁二醇中的应用。
12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于，将所述的重组菌接种至发酵培养基，20～35℃发酵培养72～144h。
13.根据权利要求12所述的应用，其特征在于，所述的发酵培养基包括碳源5～30g/L，氮源10～15g/L，无机盐8～15g/L和碳酸钙10～40g/L；优选地，所述的碳源为葡萄糖、乳糖、麦芽糖或甘油中的任意一种，所述的氮源为蛋白胨、酵母粉、肉浸液或牛肉浸膏中的任意一种或两种的组合，所述的无机盐为NaCl、KCl、MgCl2或MgSO4中的任意一种。
14.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，所述的发酵培养基包括效应物，所述的效应物为半胱氨酸、谷氨酸、柠檬酸和天冬氨酸中的任意一种或多种的组合；优选地，所述的半胱氨酸添加浓度为0.2～5g/L；所述的谷氨酸添加浓度为0.2～5g/L；所述的柠檬酸添加浓度为0.2～3g/L；所述的天冬氨酸添加浓度为0.2～5g/L；更优选地，所述的效应物为柠檬酸，添加浓度为0.8g/L。
15.根据权利要求12所述的应用，其特征在于，当发酵至OD600为0.6～0.8时加入终浓度为0.01～1mM的IPTG进行诱导，并在培养18～24h和45～50h时分别补充终浓度为20～40g/L的碳源。
...【技术特征摘要】
1.一种生产1,3-丁二醇的同工酶共表达重组菌，其特征在于，所述重组菌同时表达了bld、ald和adhe2中任意2个或2个以上的酶；
2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌同时表达了bld和ald，或者，同时表达了bld和adhe2。
3.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述的重组菌表达了thl、atob和phaa中的任意一个或多个组合的酶；
4.根据权利要求3所述的重组菌，其特征在于，所述的重组菌表达了phab，所述的phab为来源于钩虫贪铜菌的phab基因编码的乙酰乙酰辅酶a脱氢酶。
5.根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于，所述的重组菌同时表达了bld、adhe2、thl和phab，或者，同时表达了bld、ald、thl和phab，优选地是所述的重组菌同时表达了bld、adhe2、thl和phab。
6.根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于，所述的thl、phab、bld、phaa、atob、ald和adhe2基因的核苷酸序列分别顺序对应于seq id no.1-7所示的核苷酸序列。
7.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述的重组菌，其出发菌株为埃希氏菌属escherichia，优选大肠杆菌。
8.权利要求1或2所述的重组菌的构建方法，其特征在于，扩增bld、adhe2和ald中任意2个或2个以上的基因，构建重组载体，导入出发菌株，得到重组菌。
9.根据权利要求8所述的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
10.根据权利要求9所述的构建方法，其特征在于，所述的第一质粒载体...
【专利技术属性】
技术研发人员：柳东，张慧方，王振宇，张迪，李梦婷，应汉杰，牛欢青，管皓，洪舟阳，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：
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