【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】微生物中的迭代基因组编辑
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求于2019年3月8日提交的美国临时申请序列号62/816,031的优先权,所述美国临时申请出于所有目的以全文引用的方式并入本文中。
[0003]本公开涉及用于迭代地编辑微生物宿主细胞而不需要在每个编辑轮次中主动表达和利用可反选择标志物的组合物和方法。所公开的方法和组合物可以用于在所期望的宿主细胞或生物体的基因组中堆叠多个基因编辑。
技术介绍
[0004]代谢工程广泛应用于修饰微生物宿主细胞,如大肠杆菌(Escherichia coli),以产生工业相关的生物燃料或生化制品,包含乙醇、高级醇、脂肪酸、氨基酸、莽草酸前体、萜类化合物、聚酮化合物和1,4
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丁二醇的聚合物前体。通常,工业优化的菌株需要大量基因组修饰,包含插入、缺失和调节修饰,以产生此类工业相关产品。此类大量基因组编辑目标需要高效的工具来执行省时的顺序操纵或多重操纵。
[0005]虽然许多利用噬菌体重组酶介导的同源重组(重组工程)的方法使用Rac原噬菌体系统或三种噬菌体λRed蛋白——Exo、β和Gam来操纵大肠杆菌的染色体DNA,但考虑到这些方法可能是费力、耗时的和/或特征诱变效率通常低于1%,所述方法对高通量应用往往是不理想的。最近,姜威(Jiang W)等人介绍了一种利用噬菌体重组酶介导的同源重组和CRISPR/Cas9技术两者的方法(参见姜(Jiang)等人,使用CRISPR
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Cas系统对细菌基因组进行RNA引 ...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于迭代地编辑微生物宿主细胞基因组的方法,所述方法包括:a.将包括第一修复片段和选择标志基因的第一质粒引入到所述微生物宿主细胞中,其中所述微生物宿主细胞包括位点特异性限制酶,或者对位点特异性限制酶进行编码的序列与所述第一质粒一起被引入到所述微生物宿主细胞中,其中所述位点特异性限制酶靶向所述微生物宿主细胞的所述基因组中的第一基因座,并且其中所述第一修复片段包括被所述微生物宿主细胞的所述基因组中的第一基因座中或邻近所述第一基因座的基因编辑的序列分离的同源臂,其中所述同源臂包括与侧接所述微生物宿主细胞的所述基因组中的所述第一基因座的序列同源的序列;b.使来自步骤(a)的所述微生物宿主细胞在对表达所述选择标志基因的微生物宿主细胞具有选择性的培养基中生长并从源自其的培养物中分离微生物宿主细胞;c.使在步骤(b)中分离的所述微生物宿主细胞在对所述选择标志基因不具有选择性的培养基中生长并从源自其的培养物中分离微生物宿主细胞;以及d.在步骤(c)中分离的所述微生物宿主细胞中在一或多个额外轮次中重复步骤(a)
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(c),其中所述一或多个额外轮次中的每个轮次包括引入包括额外修复片段的额外质粒,其中所述额外修复片段包括被所述微生物宿主细胞的所述基因组中的基因座中或邻近所述基因座的基因编辑的序列分离的同源臂,其中所述同源臂包括与侧接所述微生物宿主细胞的所述基因组中的所述基因座的序列同源的序列,其中所述额外质粒包括与在前一选择轮次中引入的所述选择标志基因不同的选择标志基因,并且其中所述微生物宿主细胞包括位点特异性限制酶,或者对位点特异性限制酶进行编码的序列与所述额外质粒一起被引入到所述微生物宿主细胞中,所述额外质粒靶向所述微生物宿主细胞的所述基因组中的所述第一基因座或另一基因座,由此迭代地编辑所述微生物宿主细胞基因组;其中在至少一个编辑轮次之后不执行反选择。2.一种用于迭代地编辑微生物宿主细胞基因组的方法,所述方法包括:a.将第一质粒、第一向导RNA(gRNA)和第一修复片段引入到所述微生物宿主细胞中,其中所述gRNA包括与所述微生物宿主细胞的所述基因组中的第一基因座互补的序列,其中所述第一修复片段包括被所述微生物宿主细胞的所述基因组中的第一基因座中或邻近所述第一基因座的基因编辑的序列分离的同源臂,其中所述同源臂包括与侧接所述微生物宿主细胞的所述基因组中的所述第一基因座的序列同源的序列,其中所述第一质粒包括选择标志基因以及所述gRNA和所述修复片段中的至少一者或两者,并且其中:i.所述微生物宿主细胞包括RNA引导的DNA核酸内切酶;或者ii.将RNA引导的DNA核酸内切酶与所述第一质粒一起引入到所述微生物宿主细胞中;b.使来自步骤(a)的所述微生物宿主细胞在对表达所述选择标志基因的微生物宿主细胞具有选择性的培养基中生长并从源自其的培养物中分离微生物宿主细胞;c.使在步骤(b)中分离的所述微生物宿主细胞在对所述选择标志基因不具有选择性的培养基中生长并从源自其的培养物中分离微生物宿主细胞;以及d.在步骤(c)中分离的所述微生物宿主细胞中在一或多个额外轮次中重复步骤(a)
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(c),其中所述一或多个额外轮次中的每个轮次包括引入额外质粒、额外gRNA和额外修复片段,其中所述额外gRNA包括与所述微生物宿主细胞的所述基因组中的基因座互补的序列,其中所述额外修复片段同源臂被所述微生物宿主细胞的所述基因组中的基因座中或邻近
所述基因座的基因编辑的序列分离,其中所述同源臂包括与侧接所述微生物宿主细胞的所述基因组中的所述基因座的序列同源的序列,其中所述额外质粒包括与在前一选择轮次中引入的所述选择标志基因不同的选择标志基因,并且其中所述额外质粒包括所述额外gRNA和所述额外修复片段中的至少一者或两者,由此迭代地编辑所述微生物宿主细胞基因组;其中在至少一个编辑轮次之后不执行反选择。3.一种用于迭代地编辑微生物宿主细胞基因组的方法,所述方法包括:a.将包括第一修复片段和选择标志基因的第一质粒引入到所述微生物宿主细胞中,其中所述第一修复片段包括被所述微生物宿主细胞的所述基因组中的第一基因座中或邻近所述第一基因座的基因编辑的序列分离的同源臂,其中所述同源臂包括与侧接所述微生物宿主细胞的所述基因组中的所述第一基因座的序列同源的序列;b.使来自步骤(a)的所述微生物宿主细胞在对表达所述选择标志基因的微生物宿主细胞具有选择性的培养基中生长并从源自其的培养物中分离微生物宿主细胞;c.使在步骤(b)中分离的所述微生物宿主细胞在对所述选择标志基因不具有选择性的培养基中生长并从源自其的培养物中分离微生物宿主细胞;以及d.在步骤(c)中分离的所述微生物宿主细胞中在一或多个额外轮次中重复步骤(a)
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(c),其中所述一或多个额外轮次中的每个轮次包括引入包括额外修复片段的额外质粒,其中所述额外修复片段包括被所述微生物宿主细胞的所述基因组中的基因座中或邻近所述基因座的基因编辑的序列分离的同源臂,其中所述同源臂包括与侧接所述微生物宿主细胞的所述基因组中的所述基因座的序列同源的序列,并且其中所述额外质粒包括与在前一选择轮次中引入的所述选择标志基因不同的选择标志基因,由此迭代地编辑所述微生物宿主细胞基因组;其中在至少一个编辑轮次之后不执行反选择。4.根据权利要求1到3中任一权利要求所述的方法,其中所述反选择不在每个编辑轮次之后执行。5.根据权利要求1到3中任一权利要求所述的方法,其中所述反选择不在任何编辑轮次之后执行。6.根据权利要求1到3中任一权利要求所述的方法,其中所述反选择不在至少一个编辑轮次之后、每个编辑轮次之后或任何编辑轮次之后执行。7.根据权利要求1到3中任一权利要求所述的方法,其中所述反选择是基于抗生素、化学品或温度的反选择。8.根据权利要求1到3中任一权利要求所述的方法,其中所述第一质粒和所述额外质粒包括与先前引入到所述微生物宿主细胞中的每个其它或额外质粒相同的复制起点。9.根据权利要求1到3中任一权利要求所述的方法,其中所述选择标志基因包括抗生素或营养缺陷型选择标志基因。10.根据权利要求1到3中任一权利要求所述的方法,其中每个额外修复片段包括与先前修复片段上存在的所述基因编辑中的一或多个基因编辑相同的基因编辑的序列。11.根据权利要求1到3中任一权利要求所述的方法,其中每个额外修复片段包括与先前修复片段上存在的所述基因编辑中的一或多个基因编辑不同的基因编辑的序列。12.根据权利要求1到3中任一权利要求所述的方法,其中引入多个不同的第一修复片
RNA(crRNA)和反式激活crRNA(tracrRNA)。28.根据权利要求2所述的方法,其中所述第一gRNA和/或所述额外gRNA是单gRNA(sgRNA)。29.根据权利要求1到3中任一权利要求所述的方法,其中所述基因编辑选自由以下组成的群组:插入、缺失、单核苷酸多态性、基因组改组、大规模缺失、基因组编辑、质粒编辑和多重编辑或其任何组合。30.根据权利要求1到3中任一权利要求所述的方法,其中在所述一或多个额外轮次中的每个轮次中引入的所述额外修复片段靶向不同基因座并且与来自前一编辑轮次的不同选择标志基因相关联。31.根据权利要求2所述的方法,其中在所述一或多个额外轮次中的每个轮次中引入的所述额外gRNA靶向不同基因座并且与来自前一编辑轮次的不同抗生素选择标志基因相关联。32.根据权利要求1所述的方法,其进一步包括步骤(e),其中步骤(e)包括在重复步骤(a)
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(c)的终末轮次中引入包括最终修复片段的最终质粒,其中所述最终修复片段包括被所述微生物宿主细胞的所述基因组中的最终基因座中或邻近所述最终基因座的基因编辑的序列分离的同源臂,其中所述同源臂包括与侧接所述微生物宿主细胞的所述基因组中的所述最终基因座的序列同源的序列,并且其中所述最终质粒包括与在前一选择轮次中引入的所述选择标志基因不同的选择标志基因的序列,其中所述微生物宿主细胞包括位点特异性限制酶,或者对位点特异性限制酶进行编码的序列与所述最终质粒一起被引入到所述微生物宿主细胞中,所述最终质粒靶向所述微生物宿主细胞的所述基因组中的所述最终基因座。33.根据权利要求2所述的方法,其进一步包括步骤(e),其中步骤(e)包括在重复步骤(a)
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(c)的终末轮次中引入最终质粒、最终gRNA和最终修复片段,其中所述最终gRNA包括与所述微生物宿主细胞的所述基因组中的最终基因座互补的序列,其中所述最终修复片段包括被所述微生物宿主细胞的所述基因组中的最终基因座中或邻近所述最终基因座的基因编辑的序列分离的同源臂,其中所述同源臂包括与侧接所述微生物宿主细胞的所述基因组中的所述最终基因座的序列同源的序列,并且其中所述最终质粒包括与在前一选择轮次中引入的所述选择标志基因不同的选择标志基因,并且其中所述最终质粒包括所述最终gRNA和所述最终修复片段中的至少一者或两者。34.根据权利要求3所述的方法,其进一步包括步骤(e),其中步骤(e)包括在重复步骤(a)
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(c)的终末轮次中引入包括最终修复片段的最终质粒,其中所述最终修复片段包括被所述微生物宿主细胞的所述基因组中的最终基因座中或邻近所述最终基因座的基因编辑的序列分离的同源臂,其中所述同源臂包括与侧接所述微生物宿主细胞的所述基因组中的所述最终基因座的序列同源的序列,并且其中所述最终质粒包括与在前一选择轮次中引入的所述选择标志基因不同的选择标志基因。35.根据权利要求32到34中任一权利要求所述的方法,其中所述最终基因座是与先前编辑的任何基因座不同的基因座。36.根据权利要求33所述的方法,其中所述最终基因座是与先前引入到所述微生物宿主细胞中的gRNA所靶向的任何基因座不同的基因座。
37.根据权利要求32到34中任一权利要求所述的方法,其进一步包括步骤(f),其中步骤(f)包括引入包括与存在于所述最终修复片段上或与所述最终修复片段相关联的序列互补的向导序列的gRNA,以促进通过RNA引导的DNA核酸内切酶在所述终末轮次之后去除所述最终修复片段。38.根据权利要求1到3中任一权利要求所述的方法,其中所述微生物宿主细胞包括来自一或多个异源重组系统的一组蛋白质。39.根据权利要求1到3中任一权利要求所述的方法,其中所述微生物宿主细胞包括来自异源重组系统的一组蛋白质,所述异源重组系统选自λred重组系统、RecET重组系统、Red/ET重组系统、来自λred重组系统或RecET重组系统的蛋白质的任何同源物、直系同源物或旁系同源物或其任何组合。40.根据权利要求39所述的方法,其中来自所述λred重组系统的所述一组蛋白质包括β蛋白、gam蛋白和exo蛋白。41.根据权利要求38所述的方法,其中在步骤(a)之前,来自所述异源重组系统的所述一组蛋白质在包括对来自所述异源重组系统的所述一组蛋白质进行编码的基因的质粒上被引入到所述微生物宿主细胞中。42.根据权利要求38所述的方法,其中由于对来自所述异源重组系统的所述一组蛋白质进行编码的基因整合到所述微生物宿主细胞的基因组中,因此来自所述异源重组系统的所述一组蛋白质被所述微生物宿主细胞稳定地表达。43.根据权利要求38所述的方法,其中来自所述异源重组系统的所述一组蛋白质位于与诱导型启动子可操作地连接的操纵子中。44.根据权利要求43所述的方法,其中所述诱导型启动子可通过添加或耗竭试剂或通过温度变化来诱导。45.根据权利要求44所述的方法,其中所述试剂选自由以下组成的群组:阿拉伯糖、异丙基β
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硫代半乳糖苷(IPTG)和四环素。46.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法,其中所述引入步骤包括转化所述微生物宿主细胞。47.根据权利要求1到3中任一权利要求所述的方法,其中所述微生物宿主细胞是真核细胞。48.根据权利要求47所述的方法,其中所述微生物宿主细胞是酵母细胞。49.根据权利要求48所述的方法,其中所述酵母细胞是酿酒酵母。50.根据权利要求47所述的方法,其中所述微生物宿主细胞是丝状真菌。51.根据权利要求50所述的方法,其中所述丝状真菌是黑曲霉。52.根据权利要求1到3中任一权利要求所述的方法,其中所述微生物宿主细胞是原核细胞。53.根据权利要求52所述的方法,其中所述原核宿主细胞是大肠杆菌或谷氨酸棒状杆菌。54.一种用于从微生物宿主细胞中清除先前存在的质粒的方法,所述方法包括:a.将包括第一选择标志基因的第一质粒引入到包括先前存在的质粒的所述微生物宿主细胞中;以及
b.使来自步骤(a)的所述微生物宿主细胞在对表达所述选择标志基因的微生物宿主细胞具有选择性的培养基中生长并从源自其的培养物中分离微生物宿主细胞,其中所述先前存在的质粒和所述引入的第一质粒包括相同的复制起点,由此从微生物宿主细胞中清除所述先前存在的质粒;其中不执行反选择以促进先前存在的质粒的清除。55.根据权利要求54所述的方法,其进一步包括步骤(c),所述步骤(c)包括使在步骤(b)中分离的所述微生物宿主细胞在对所述选择标志基因不具有选择性的培养基中生长并从源自其的培养物中分离微生物宿主细胞。56.根据权利要求55所述的方法,其进一步包括在一或多个轮次中重复步骤(a)
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(c),其中所述一或多个轮次中的每个轮次包括引入包括与在前一选择轮次中引入的所述选择标志基因不同的选择标志基因的额外质粒,其中所述先前存在的质粒和另外引入的质粒包括相同的复制起点。57.根据权利要求54到56中任一权利要求所述的方法,其中所述先前存在的质粒是天然质粒或异源质粒。58.一种用于从微生物宿主细胞中迭代地清除先前引入的质粒的方法,所述方法包括:a.将包括第一选择标志基因的第一质粒引入到所述微生物宿主细胞中;b.使来自步骤(a)的所述微生物宿主细胞在对表达所述选择标志基因的微生物宿主细胞具有选择性的培养基中生长并从源自其的培养物中分离微生物宿主细胞;c.使在步骤(b)中分离的所述微生物宿主细胞在对所述选择标志基因不具有选择性的培养基中生长并从源自其的培养物中分离微生物宿主细胞;以及d.在一或多个轮次中重复步骤(a)
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(c),其中所述一或多个轮次中的每个轮次包括引入包括与在前一选择轮次中引入的所述选择标志基因不同的选择标志基因的额外质粒,并且其中所述第一质粒和所述额外质粒包括与先前引入到所述微生物宿主细胞中的每个其它第一质粒或额外质粒相同的复制起点,由此从微生物宿主细胞中迭代地清除所述先前引入的第一质粒或额外质粒;其中不执行反选择以促进先前引入的质粒的清除。59.根据权利要求54或权利要求58所述的方法,其中所述反选择不在至少一个编辑轮次之后、每个编辑轮次之后或任何编辑轮次之后执行。60.根据权利要求54或权利要求58所述的方法,其中所述反选择是基于抗生素、化学品或温度的反选择,并且所述反选择不在至少一个编辑轮次之后、每个编辑轮次之后或任何编辑轮次之后执行。61.根据权利要求54或权利要求58所述的方法,其中所述选择标志基因包括抗生素或营养缺陷型选择标志基因。62.根据权利要求54或权利要求58所述的方法,其中所述引入步骤包括转化所述微生物宿主细胞。63.根据权利要求54或权利要求58所述的方法,其中所述微生物宿主细胞是真核细胞。64.根据权利要求63所述的方法,其中所述微生物宿主细胞是酵母细胞。65.根据权利要求64所述的方法,其中所述酵母细胞是酿酒酵母。66.根据权利要求63所述的方法,其中所述微生物宿主细胞是丝状真菌。
67.根据权利要求66所述的方法,其中所述丝状真菌是黑曲霉。68.根据权利要求54或权利要求58所述的方法,其中所述微生物宿主细胞是原核细胞。69.根据权利要求65所述的方法,其中所述原核宿主细胞是大肠杆菌或谷氨酸棒状杆菌。70.根据权利要求1到3、权利要求54或权利要求58中任一权利要求所述的方法,其进一步包括对在...
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