提高威兰胶表达的多酶复合体载体及高产威兰胶的重组菌制造技术

本发明专利技术公开了一种提高威兰胶表达的多酶复合体载体及高产威兰胶的重组菌，属于分子生物学技术领域。本发明专利技术提高威兰胶表达的多酶复合体载体，是将DNA支架序列、TALE1‑ugpG和TALE2‑welB构建到pBBR1SMCS‑BB质粒中获得的；本发明专利技术的多酶复合体载体通过模拟底物沟道传递效应，提高威兰胶的表达。将本发明专利技术成功构建的多酶复合体表达载体整合到威兰胶菌株中，获得的重组菌株发酵威兰胶的产量较野生菌株显著提高，为威兰胶的工业化生产奠定基础。

【技术实现步骤摘要】
提高威兰胶表达的多酶复合体载体及高产威兰胶的重组菌
本专利技术属于分子生物学
，具体涉及一种提高威兰胶表达的多酶复合体载体及高产威兰胶的重组菌。
技术介绍
威兰胶(Welangum，曾编号S-130)又名威伦胶、韦兰胶或沃伦胶，是由革兰氏阴性鞘氨醇单胞菌合成的一种胞外杂多糖，分子量可以高达数百万，它是美国KELCO公司开发的继黄原胶和结冷胶之后，目前最具有市场应用前景的微生物多糖之一。威兰胶的主链主要由D-葡萄糖、D-葡萄糖醛酸、D-葡萄糖和L-鼠李糖按顺序组成的四糖重复单元构成，其合成过程为多酶级联反应。目前，国内关于威兰胶的研究工作主要为威兰胶菌种选育、摇瓶培养基优化、威兰胶流变学性质及其影响因素等方面，其生产方法是鞘氨醇单胞菌属利用天然的碳水化合物在细胞内发酵后分泌至胞外，天然微生物生产发酵产量较低，难以满足人们对新型微生物多糖的需求。生物合成胞外多糖的过程需要多种酶的参与，作用机制十分复杂。关于威兰胶的具体合成途径尚处于探索之中。根据前期的研究报道，鞘氨醇胶的合成基因具有较高的同源性，表明他们具有非常类似的合成机制。根据结冷胶的合成途径推测威兰胶具体的生物合成途径发现，在威兰胶的合成途径中，UDP-葡萄糖焦磷酸化酶(UgpG)将葡萄糖转化为UDP-葡萄糖后，糖基转移酶——葡萄糖磷酸异戊二烯转移酶WelB接着将葡萄糖-1-磷酸从UDP-葡萄糖上转移并整合到脂载体磷酸异戊二烯(IP)上，合成葡糖基-异戊二烯磷酸。UgpG催化形成的产物是WelB作用的底物，两种酶催化的反应是天然的级联酶促反应，在威兰胶合成过程中有重要意义。随着人们对微生物多糖合成途径及关键酶的不断探索，通过微生物多糖的代谢工程来提高微生物多糖产量的方法取得了很大进展。但是仅通过改变代谢酶活性及提高代谢酶含量或敲除竞争途径的方法并不一定能够起到提高目标产物产量的目的，有时还会引起胁迫效应，反而降低目标产物产量。近年来，人们在细胞内代谢途径中发现了许多天然的多酶复合体，通过底物沟道传递效应使代谢酶的催化效率大大提高。受底物沟道传递效应的启发，人们试图采取构建人工支架的方式，在空间上拉近级联酶的距离，构建多酶复合体，模拟底物沟道传递效应，提高级联酶的催化效率。但是传统的人工支架如DNA支架、RNA支架和蛋白质支架由于自身的缺陷，限制了他们在体内的应用。
技术实现思路
针对现有技术中存在的问题，本专利技术的目的在于提供一种提高威兰胶表达的多酶复合体载体及高产威兰胶的重组菌。本专利技术利用TALE与DNA支架的特异性相互作用构建人工支架，将威兰胶合成过程中的代谢酶进行空间组装，构建多酶复合体，模拟底物沟道传递与加工机制，建立代谢酶空间组织工程的方法，构建威兰胶高产菌株，为后续重组菌发酵生产威兰胶奠定基础。为了达到上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种提高威兰胶表达的多酶复合体支架，包括DNA支架序列、TALE1-UgpG和TALE2-WelB；其中，所述DNA支架序列包含11个重复单元，每一个重复单元包括一个结合基序BM1和一个结合基序BM2；所述结合基序BM1和结合基序BM2之间有6bp的间隔序列；所述结合基序BM1的核酸序列为：5’-CTGCCCTCCTGGTT-3’；所述结合基序BM2的核酸序列为：5’-CCAGAAACAACACT-3’；所述TALE1-UgpG的编码序列如SEQIDNO:12所示；所述TALE2-WelB的编码序列如SEQIDNO:13所示。一种提高威兰胶表达的多酶复合体载体，将DNA支架序列、TALE1-ugpG和TALE2-welB构建到pBBR1SMCS-BB质粒中获得的pBBR1SMCS-BB-T1U-T2B-DS即为提高威兰胶表达的多酶复合体载体；其中，所述DNA支架序列包含11个重复单元，每一个重复单元包括一个结合基序BM1和一个结合基序BM2；所述结合基序BM1和结合基序BM2之间有6bp的间隔序列；所述结合基序BM1的核酸序列为：5’-CTGCCCTCCTGGTT-3’；所述结合基序BM2的核酸序列为：5’-CCAGAAACAACACT-3’，所述TALE1-ugpG的核酸序列如SEQIDNO:12所示；所述TALE2-welB的核酸序列如SEQIDNO:13所示；所述pBBR1SMCS-BB质粒是由pBBR1MCS-3质粒消除自带的酶切位点SpeI和XbaI后，再在Lac启动子上游和终止子下游分别引入AflII、SpeI和XbaI、BglII两组酶切位点改造成的质粒。在上述方案的基础上，所述pBBR1SMCS-BB质粒的构建方法为：①使用限制酶SpeI、XbaI对质粒pBBR1MCS-3进行双酶切，将双酶切后的质粒进行自连，得到形成新的scar序列的质粒pBBR1SMCS；②以pBBR1SMCS质粒为模板，利用PCR分别扩增pBBR1SMCS质粒基因表达区和质粒除表达区外的主体部分，在PCR过程中通过引物分别在pBBR1SMCS质粒Lac启动子上游和终止子下游引入酶切位点AflII、SpeI和XbaI、BglII两组酶切位点；③利用In-fusioncloning方法将步骤②PCR获得的两个片段进行连接，获得改造质粒pBBR1SMCS-BB。在上述方案的基础上，所述pBBR1SMCS质粒基因表达区的扩增引物对为：SFFor：5’-CTTAAGCCTAGGACTAGTGCGCAACGCAATTAATGTGA-3’；SFRev：5’-AGATCTACGCGTTCTAGATCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGC-3’；所述pBBR1SMCS质粒除表达区外的主体部分的扩增引物对为：LFFor：5’-TCTAGAACGCGTAGATCTCTGCGATGAGTGGCAGGGCGG-3’；LFRev：5’-ACTAGTCCTAGGCTTAAGTCACTGCCCGCTTTCCA-3’。上述多酶复合体支架和上述的多酶复合体载体在威兰胶表达中的应用。一种高产威兰胶的重组菌，将上述的多酶复合体载体整合到威兰胶生产菌鞘氨醇单胞菌中。上述高产威兰胶重组菌的构建方法，采用三亲杂交法将上述的多酶复合体载体整合到威兰胶生产菌鞘氨醇单胞菌中，具体是以鞘氨醇单胞菌作为受体菌；携带上述的多酶复合体载体的E.coli作为供体菌；携带pRK2013的E.coli作为辅助菌；三者按比例混合培养使pBBR1SMCS-BB-T1U-T2B-DS整合到鞘氨醇单胞菌中。在上述方案的基础上，所述受体菌为鞘氨醇单胞菌Sphingomonassp.WG，保藏号为：CCTCCNo:M2013161。使用上述高产威兰胶的重组菌发酵生产威兰胶的方法，步骤为：(1)将活化后的重组菌接种到种子培养基中，28℃、150rpm培养16h至对数期，获得种子液；(2)将种子液按照5％(v/v)的接种量接种至发酵培养基中，32.5本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种提高威兰胶表达的多酶复合体支架，其特征在于，包括DNA支架序列、TALE1-UgpG和TALE2-WelB；/n其中，所述DNA支架序列包含11个重复单元，每一个重复单元包括一个结合基序BM1和一个结合基序BM2；所述结合基序BM1和结合基序BM2之间有6bp的间隔序列；/n所述结合基序BM1的核酸序列为：5’-CTGCCCTCCTGGTT-3’；/n所述结合基序BM2的核酸序列为：5’-CCAGAAACAACACT-3’；/n所述TALE1-UgpG的编码序列如SEQ ID NO:12所示；/n所述TALE2-WelB的编码序列如SEQ ID NO:13所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种提高威兰胶表达的多酶复合体支架，其特征在于，包括DNA支架序列、TALE1-UgpG和TALE2-WelB；
其中，所述DNA支架序列包含11个重复单元，每一个重复单元包括一个结合基序BM1和一个结合基序BM2；所述结合基序BM1和结合基序BM2之间有6bp的间隔序列；
所述结合基序BM1的核酸序列为：5’-CTGCCCTCCTGGTT-3’；
所述结合基序BM2的核酸序列为：5’-CCAGAAACAACACT-3’；
所述TALE1-UgpG的编码序列如SEQIDNO:12所示；
所述TALE2-WelB的编码序列如SEQIDNO:13所示。


2.一种提高威兰胶表达的多酶复合体载体，其特征在于，将DNA支架序列、TALE1-ugpG和TALE2-welB构建到pBBR1SMCS-BB质粒中获得的pBBR1SMCS-BB-T1U-T2B-DS即为提高威兰胶表达的多酶复合体载体；
其中，所述DNA支架序列包含11个重复单元，每一个重复单元包括一个结合基序BM1和一个结合基序BM2；所述结合基序BM1和结合基序BM2之间有6bp的间隔序列；
所述结合基序BM1的核酸序列为：5’-CTGCCCTCCTGGTT-3’；
所述结合基序BM2的核酸序列为：5’-CCAGAAACAACACT-3’，
所述TALE1-ugpG的核酸序列如SEQIDNO:12所示；
所述TALE2-welB的核酸序列如SEQIDNO:13所示；
所述pBBR1SMCS-BB质粒是由pBBR1MCS-3质粒消除自带的酶切位点SpeI和XbaI后，再在Lac启动子上游和终止子下游分别引入AflII、SpeI和XbaI、BglII两组酶切位点改造成的质粒。


3.根据权利要求2所述提高威兰胶表达的多酶复合体载体，其特征在于，所述pBBR1SMCS-BB质粒的构建方法为：
①使用限制酶SpeI、XbaI对质粒pBBR1MCS-3进行双酶切，将双酶切后的质粒进行自连，得到形成新的scar序列的质粒pBBR1SMCS；
②以pBBR1SMCS质粒为模板，利用PCR分别扩增pBBR1SMCS质粒基因表达区和质粒除表达区外的主体部分，在PCR过程中通过引物分别在pBBR1SMCS质粒Lac启动子上游和终止子下游引入酶切位点AflII、SpeI和XbaI、BglII两组酶切位点；
③利用In-fusioncloning方法将步骤②PCR获得的两个片段进行连接，获得改造质粒pBBR1SMCS...

【专利技术属性】
技术研发人员：李慧，朱虎，王继乾，常爱平，黎可卉，姬思雪，郭中瑞，薛含，
申请(专利权)人：中国石油大学华东，福建师范大学，
类型：发明
国别省市：山东;37