一株裂解性噬菌体及其在防控烟草土传青枯病的应用制造技术

本发明专利技术公开了一株裂解性噬菌体FQ44，分类命名为茄科劳尔氏菌噬菌体(Ralstoniasolanacearum phage)，于2020年9月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，噬菌体保藏号为CCTCC NO：M2020560。本发明专利技术还公开了所述的噬菌体FQ44在防控烟草土传青枯病的应用，采用灌根法将噬菌体施入土壤。本发明专利技术通过使用青枯菌专性噬菌体抑制烟草土传青枯病，在防控土传青枯病的同时避免了对土壤中普通微生物群落的伤害。室内的相关实验表明，噬菌体FQ44属于肌尾噬菌体科，可以有效抑制部分烟草青枯菌的生长，按最佳感染复数(MOI 1～10)施用时效果最好；田间实验效果也表明其可以有效抑制青枯病的发生，具有广阔的前景。

【技术实现步骤摘要】
一株裂解性噬菌体及其在防控烟草土传青枯病的应用
本专利技术属于微生物
，涉及一种噬菌体及其在防控烟草青枯病的应用，具体涉及一株裂解性噬菌体FQ44及其在防控烟草土传青枯病的应用。
技术介绍
烟草青枯病是由茄科劳尔氏菌(Ralstoniasolanacearum，简称青枯菌)引起的一种土传病害，多发于我国烟草种植地区，可导致烟草发生不可逆的萎蔫、死亡，造成烟草严重减产，制约着烟草经济的发展。施用农药或熏蒸等传统方式可在短时间内杀灭土传青枯菌，有效减缓病害的发生。但上述方法容易诱导病原菌的耐药性，且会杀灭土壤中的土著微生物、破坏土壤微生物稳态，还会污染环境并影响烟草的品质。噬菌体是一种专性侵染细菌的病毒，自然界中普遍存在。裂解性噬菌体侵染细菌后会裂解宿主细胞，影响细菌的新陈代谢，有效控制宿主细菌的数量。利用噬菌体裂解细菌治疗病原菌感染的治疗手段称为噬菌体疗法[1]。噬菌体疗法具有特异性、高效性等一些其他抗菌剂无法比拟的优点，逐渐成为新型药物开发的研究热点之一。因此，通过噬菌体裂解病原菌来防控烟草青枯病害具有广阔的应用前景。
技术实现思路
本专利技术的目的在于分离得到可以专性裂解烟草青枯菌的噬菌体，检测其基础生物学特性，包括噬菌斑大小、宿主范围、电镜形态、最佳感染复数和一步生长曲线，并检测了该噬菌体对烟草青枯菌的室内抑菌效果和烟草青枯病的田间防治效果，为开发新型、高效的抗烟草青枯病噬菌体制剂提供理论依据。专利技术人发现：室内实验中，青枯菌专性噬菌体可以特异性裂解从烟草根际土分离得到的青枯菌，还可以裂解部分来自其他土壤-作物系统的病原青枯菌；田间实验中，施用噬菌体后可以有效预防烟草青枯病的发生。本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的：一株裂解性噬菌体FQ44，分类命名为茄科劳尔氏菌噬菌体(Ralstoniasolanacearumphage)，于2020年9月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，噬菌体保藏号为CCTCCNO：M2020560。裂解性噬菌体FQ44属于有尾噬菌体目，肌尾噬菌体科(Myoviridae)。所述的噬菌体FQ44的宿主菌为YNYC-23，分类命名为茄科劳尔氏菌(Ralstoniasolanacearum)，于2020年9月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCCNO：M2020559。本专利技术的另一个目的是提供所述的裂解性噬菌体FQ44在防控烟草土传青枯病的应用。优选的，采用灌根法将噬菌体施入烟草根部土壤。优选的，噬菌体的终滴度为1×107～1×108PFU/g土。本专利技术的另一个目的是提供一种防控烟草土传青枯病的噬菌体制剂，所述的噬菌体制剂中包含本专利技术所述的裂解性噬菌体FQ44，噬菌体制剂的滴度为1×108～1×109PFU/mL。所述的噬菌体菌剂由以下方法制得：采用NA液体培养基培养得到对数生长期的青枯菌菌液，用无菌水将青枯菌菌液OD600值调整至0.45～0.55；用无菌水调节噬菌体滴度为1×108～1×109PFU/mL，按照最佳感染复数(MOI1～10)置于OD600值为0.45～0.55的青枯菌菌液中，30℃、150～180rpm振荡培养9～12h，12000～14000rpm离心3min，取上清液，用0.22μm滤膜过滤；用无菌水调节噬菌体滴度为1×108～1×109PFU/mL，得到噬菌体菌剂。所述的青枯菌菌液是由以下方法制得：茄科劳尔氏菌采用M-SMSA固体培养基活化，挑取茄科劳尔氏菌单菌落转接到NA液体培养基中，在30℃，170rpm摇床培养，得到对数生长期的青枯菌菌液。培养基配方如下：NA液体培养基：葡萄糖10g、蛋白胨5g、牛肉浸膏3g、酵母粉0.5g、去离子水1000mL，调节pH7.2～7.4，115℃高压灭菌30min。M-SMSA固体培养基(青枯菌半选择性固体培养基)：在1000mLNA固体培养基中加入TTC50mg、结晶紫5mg、多粘菌素50mg、杆菌肽25mg、氯霉素5mg、放线菌酮50mg、青霉素5mg。本专利技术的另一个目的是提供一种采用本专利技术所述的裂解性噬菌体FQ44防控烟草土传青枯病的方法，包括：烟草幼苗移栽7～30天后，以灌根法将噬菌体菌剂加入烟草根部土壤中，噬菌体的终滴度为1×107～1×108PFU/g土。本专利技术的有益效果：本专利技术采用灌根法将噬菌体施入土壤抑制烟草土传青枯病，噬菌体只能侵染青枯菌，在防控土传青枯病的同时降低了对土壤中土著微生物群落的扰动。室内的相关实验表明，噬菌体FQ44属于肌尾噬菌体科，可以有效抑制部分烟草青枯菌的生长，按最佳感染复数(MOI1～10)施用时效果最好；田间实验效果也表明其可以有效抑制青枯病的发生，具有广阔的前景。附图说明图1为噬菌体FQ44的噬菌斑形态。图2为噬菌体FQ44在透射电子显微镜下的形态。图3为噬菌体FQ44的一步生长曲线。图4为噬菌体FQ44对宿主青枯菌YNYC-23的抑菌效果。图5为噬菌体FQ44的宿主范围。图6为28株青枯菌之间的亲缘关系。图7为噬菌体FQ44田间抑制烟草青枯病的效果。生物保藏信息：噬菌体FQ44，分类命名为茄科劳尔氏菌噬菌体(Ralstoniasolanacearumphage)，于2020年9月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址：湖北省武汉市武汉大学，噬菌体保藏号为CCTCCNO：M2020560。宿主菌YNYC-23，分类命名为茄科劳尔氏菌(Ralstoniasolanacearum)，于2020年9月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址：湖北省武汉市武汉大学，菌种保藏号为CCTCCNO：M2020559。具体实施方式下面结合具体实施方式对本专利技术的技术方案作进一步说明。实施例1青枯菌的分离取云南省青枯病发病区域采集得到的烟草植株根际土壤样品1g，放入已灭菌的含有9mL去离子水的50mL三角瓶中(水土比1:9)。将锥形瓶放入30℃、150～180rpm的摇床中培养30～60min，获得土壤悬液。取土壤悬液进行梯度稀释，具体做法：取100μL土壤悬液，加入到含有900μL无菌水的离心管中，涡旋；获得稀释梯度为10-1的土壤悬液，重复此步骤进行梯度稀释，获得稀释梯度为10-2、10-3、10-4的土壤悬液。取各稀释梯度的土壤悬液100μL，利用青枯菌半选择性M-SMSA固体培养基进行涂布。每个稀释梯度设3个重复。将平板倒置于在30℃的恒温培养箱中培养48h。挑取边缘白色、中心粉色且具有流动性的单菌落在M-SMSA培养基上划线，在30℃的恒温培养箱中培养48h。如此重复两到三次，直至获得纯化后的单菌。挑取纯化后的单菌落进行16SrRNA测序鉴定，确定菌株为青枯菌，并命名为YNYC-23。挑取青枯菌的单菌落接种到NA液体培养基中，在30℃、150～180rpm的摇床中培养24h，加入等体积30本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株裂解性噬菌体FQ44，分类命名为茄科劳尔氏菌噬菌体(Ralstoniasolanacearum phage)，于2020年9月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，噬菌体保藏号为CCTCC NO：M2020560。/n

【技术特征摘要】
1.一株裂解性噬菌体FQ44，分类命名为茄科劳尔氏菌噬菌体(Ralstoniasolanacearumphage)，于2020年9月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，噬菌体保藏号为CCTCCNO：M2020560。


2.权利要求1所述的裂解性噬菌体FQ44在防控烟草土传青枯病的应用。


3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于采用灌根法将噬菌体施入土壤。


4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于噬菌体的终滴度为1×107～1×108PFU/g土。


5.一种防控烟草土传青枯病的噬菌体制剂，其特征在于所述的噬菌体制剂中包含权利要求1所述的裂解性噬菌体FQ44，噬菌体制剂的滴度为1×108～1×109PFU/mL。


6.一种采用权利要求1所述的裂解性噬菌...

【专利技术属性】
技术研发人员：韦中，王硕，杨天杰，王孝芳，王佳宁，徐阳春，沈其荣，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32