一种外源性基因在空肠弯曲杆菌中表达系统的构建方法，在厌氧环境，温度控制在３７℃的条件下，包括制备启动子、穿梭质粒的构建以及空肠弯曲杆菌生物发光转基因模型的建立的步骤。本发明专利技术通过电转化转入空肠弯曲杆菌ＡＴＣＣ３３２９１和ＡＴＣＣ３５９２１在卡那霉素抗生素的选择压下表达，无需添加任何底物可以观测到生物冷光，直观表达生物信息，具有广阔的研究前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种外源性基因表达系统的构建方法及其穿梭质粒，具体涉及一种外源性基因(Lux)在空肠弯曲杆菌中表达系统的构建方法及其穿梭质粒。
技术介绍
近几年来基因重组技术得到了迅速的发展，人们已经能将具有某种功能的基因连接到适当的载体上并通过化学或物理的方法转化到细菌或植物、动物细胞中，这一技术已经应用于制造外源蛋白质产品，器官移植，动、植物转基因育种、基因治疗、生物感应器等方面有广阔的应用前景。 如今，人们利用外源基因表达技术生产生物传感器，和传统检测方法不同，新的生物传感器是将编码某种发光物质的外援基因(DNA或RNA)直接倒入某种微生物体内，并通过宿主细胞的表达系统合成外源性基因代谢产物，通过理化检测代谢产物的合成数量以达到无害快速检测监测的目的。Lux基因是编码和调控发光细菌生物发光的操纵子，其中主要有五个基因(Lux ABCDE)共同存在于所有的发光细菌中，并以lux CDABE顺序排列，分别编码不同的功能亚单位。Lux报告基因生物发光检测系统，是用荧光素酶(Lux)基因标记细胞或DNA，利用光学检测仪器，研究人员能够直接监控活体生物体内的细胞活动和基因行为。通过这个系统，可以观测活体动物体内肿瘤的生长及转移、感染性疾病发展变化、特定基因的表达等生物学过程。然而传统的动物实验方法需要在不同的时间点宰杀实验动物或破碎细胞以获得数据，得到多个时间点的实验结果。相比之下，该技术通过对同一组实验对象在不同时间点进行记录，跟踪同一观察目标(标记细胞及基因)的移动及变化，所得的数据更加真实可信。另外，这一技术因其操作简单、不涉及放射性物质、所得结果直观、灵敏度高等特点，近年来在医学研究及药物开发、高产量药物的筛选、基因治疗实验、以及在生物传感器的构建中发挥着其独特的功能。 1989年PARK, S.F.和STIRLING, D. A.第一个成功的将Lux基因用作生物发光报告基因应用于检测大肠杆菌Escherichia Coli K12功能基因表达以来，引起了人们的广泛关注。由于Lux报告基因生物发光技术在使用中具备以下特点(l)由原核基因编码的基因产物与同转染前真核细胞内任何相似的产物相区别；(2)细胞内其它基因产物不会干扰报告基因产物的检测；(3)编码产物的检测快速、简便、灵敏度高而且重现性好。目前，Lux报告基因生物发光技术已经被证明是一种有效的、多功能的生物学分析工具，以其独特的优势，被广泛地应用于病毒学研究、食源性有害微生物快速检测、构建转基因微生物及动物模型、siRNA研究、干细胞研究、蛋白质相互作用研究以及细胞体外检测等领域。 但是，迄今为止，国内外尚未将见将Lux报告基因生物发光技术应用于空肠弯曲杆菌研究领域的报道。本专利依据Lux报告基因生物发光技术的不丢失细胞活性，不破坏细胞膜、快速、灵敏、易于检测的生物学特点，将Lux报告基因生物发光技术引入到空肠弯曲杆菌的研究领域，通过建立稳定、灵敏、强发光可用于动物活体检测的空肠弯曲杆菌发光模型，进一步利用Lux报告基因在分子水平研究空肠弯曲杆菌。相信它的成功将为深入研究空肠弯曲杆菌的生物学特性及致病机理提供坚实的理论基础和全新的方法途径。 Lux基因生物传感器发展的制约因素是如何将外源发光基因Lux在表达系统中高效表达，即如何建立外源基因的高效表达系统，所谓外源基因是指生物体正常基因中原来不存在的外来的基因，细胞可以通过基因操作技术来获得外源基因。外源基因表达系统近几年得到了迅速的发展，被认为是最具有发展前景的生产功能蛋白质及建立生物传感器的重要工具之一，外源性Lux基因表达主要分为下列步骤 1.目的基因(Lux)的选择、克隆和加工 基因由于具有某种功能而被利用，即成为目的基因，目的基因的选择至关重要。构建生物发光传感器时，通常是选择Lux及gfp基因作为目的基因，因为检测方便，最好是选择可进行活体检测的Lux基因。基因按照其顺序一次分为几部分启动子，编码序列，终止序列。所述的目的基因为某一种生物的基因，由于其在此种生物的体内的表达量很低，或者由于此种生物缺乏而不能满足人类的需要，所以将目的基因克隆出来，去掉目的基因的天然启动子，将强启动子序列和目的基因合并成融合基因。 2.目的基因(Lux)和载体的结合 目前常用的载体为质粒、病毒体载体、噬菌体载体等，如大肠杆菌质粒、腺病毒、M13噬菌体等，载体的必备要素为具有选择基因、至少一个和目的基因共同的单一限制性内切酶位点、能够自主复制，有些载体还具有启动子。将目的基因或序列插入载体，主要靠双链粘性末端_即单链部分之间的互补，即DNA连接酶的连接作用。如果目的基因序列两端有与载体上相同的限制性内切酶的酶切位点，则不同来源的DNA的同一限制性内切酶切开产生的粘性末端，在降低温度退火时，可以互补配对，在DNA连接酶的作用下，目的序列就可以与载体序列连接。T4DNA连接酶可连接DNA-DNA、DNA-RNA、RNA-RNA和双链DNA粘性和平头末端，T4DNA连接酶能催化限制性内切酶切割产生的平头末端的连接，如果目的序列和载体之间没有相同的限制性酶切位点可供利用，用不同的限制性酶切割后，得到的粘性末端不能互补，则可用适当的酶将突出的末端削平(如绿豆芽核酸酶)或补齐成平末端，T4DNA再有连接酶连接。 以pRY107质粒为列，该质粒是一个带有抗卡那霉素(Kana)基因的克隆载体，是一个环状质粒，在质粒中含有三个单一的限制性内切酶酶切位点。选择外源DNA的粘性末端就和pRY107质粒的粘性末端互补配对，再用连接酶连接，此时，外源DNA的粘性末端就和pRY107质粒的DNA融合，因为多个单克隆位点都位于抗性基因外，外源DNA的插入就可以通过外加抗生素(卡那霉素)来检测外源DNA是否转入到受体细胞中。 3.目的基因(Lux)在受体中复制或表达 以pRY107质粒为例pRY107质粒以大肠杆菌质粒为基本骨架，带有细菌复制子(ORI)，包括大肠杆菌和空肠弯曲杆菌的复制区。将空肠弯曲杆菌致病基因flaA的启动子promoter通过双酶切和连接技术同pRY107质粒融合，构建成携带有外源基因LuxCDABE和空肠弯曲杆菌致病基因flaA的启动子的pRY107LuxCDABE质粒。 携带有外源基因LuxCDABE的pRY107LuxCDABE质粒转入大肠杆菌后，可以在细胞内大量复制繁殖，转入空肠弯曲杆菌则表达。 无论是只克隆目的基因、还是将目的基因和载体融合后转入受体中大量表达，都需要应用PCR技术PCR技术实际上是在模板DNA、引物和4种脱氧核糖核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。反应分为3步。1变形(denaturation)通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，双链解离形成单链DNA ;2退火(annealling)当温度突然降低时，由于模板分子结构较引物复杂得多，而且反应体系中引物DNA的量大大多余模板DNA，使引物和其互补的模板在局部形成铰链，而模板DNA双链之间的互补机会较少；3延伸(extension)在DNA聚合酶和4种脱氧核糖核苷三磷酸底物存在下，5'-----3'的聚合酶催化以引物为起点的DNA链延伸反应。以上三步为一个循环，每一个循环的产物可以作为下一个循环的模板，介于两个本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种外源性基因在空肠弯曲杆菌中表达系统的构建方法，其特征在于，该构建方法包括以下步骤： 以下步骤的实施条件均为厌氧环境，温度控制在３７℃； １）制备启动子 ａ．使用试剂盒分离纯化空肠弯曲杆菌ＤＮＡ； ｂ．对得到的空肠弯曲杆菌ＤＮＡ，通过ＰＣＲ克隆空肠弯曲杆菌ｆｌａＡ基因的启动子σ２８ＮＣ＿００２１６３； ２）穿梭质粒的构建 ａ．用双酶切已克隆的启动子，同时用同样的方法酶切质粒ｐＲＹ１０７，并去磷酸化处理防止自连； ｂ．用连接酶连接（Ｔ４ＤＮＡ连接酶），温度控制在１６℃，反应２０～２４ｈ，将克隆的空肠弯曲杆菌ｆｌａＡ基因的启动子σ２８ＮＣ＿００２１６３与无启动子且含来自无色杆菌的ｌｕｘＣＤＡＢＥ基因全序列质粒ｐＲＹ１０７融合，构建融合质粒载体ｐＲＹ１０７ｌｕｘＣＤＡＢＥ； ｃ．将构建的质粒通过电转化转入大肠杆菌，以抗生素卡那霉素（ｋａｎａ）为选择压，筛选转化体，并得到可发出生物冷光的转化体； ３）空肠弯曲杆菌生物发光转基因模型的建立 ａ．将构建好的质粒载体ｐＲＹ１０７ｌｕｘＣＤＡＢＥ利用电转化转入大肠杆菌，扩大后用质粒提取试剂盒，提取质粒并纯化； ｂ．再通过电转化将构建的质粒载体ｐＲＹ１０７ｌｕｘＣＤＡＢＥ转入空肠弯曲菌中并表达，形成空肠弯曲杆菌生物发光转基因模型，完成外源性基因ｌｕｘ在空肠弯曲杆菌中表达系统的构建。...
【技术特征摘要】
一种外源性基因在空肠弯曲杆菌中表达系统的构建方法，其特征在于，该构建方法包括以下步骤以下步骤的实施条件均为厌氧环境，温度控制在37℃；1)制备启动子a.使用试剂盒分离纯化空肠弯曲杆菌DNA；b.对得到的空肠弯曲杆菌DNA，通过PCR克隆空肠弯曲杆菌flaA基因的启动子σ28NC_002163；2)穿梭质粒的构建a.用双酶切已克隆的启动子，同时用同样的方法酶切质粒pRY107，并去磷酸化处理防止自连；b.用连接酶连接(T4DNA连接酶)，温度控制在16℃，反应20～24h，将克隆的空肠弯曲杆菌flaA基因的启动子σ28NC_002163与无启动子且含来自无色杆菌的luxCDABE基因全序列质粒pRY107融合，构建融合质粒载体pRY107luxCDABE；c.将构建的质粒通过电转化转入大肠杆菌，以抗生素卡那霉素(kana)为选择压，筛选转化体，并得到可发出生物冷光的转化体；3)空肠弯曲杆菌生物发光转基因模型的建立a.将构建好的质粒载体pRY107luxCDABE利用电转化转入大肠杆菌，扩大后用质粒提取试剂盒，提取质粒并纯化；b.再通过电转化将构建的质粒载体pRY107luxCDABE转入空肠弯曲菌中并表达，形成空肠弯曲杆菌生物发光转基因模型，完成外源性基因lux在空肠弯曲杆菌中表达系统的构建。2. 根据权利要求1所述外源性基因在空肠弯曲杆菌中表达系统的构建方法，其特征在 于，通过PCR克隆空肠弯曲杆菌flaA基因的启动子o 28NCJ)02163，具体的引物和PCR过程 如下上游5' -ACGCGAATTCAATATTTACCAAAAACTTTAACAACC-3，下游5' -ACGCGTCGACTCCTTTAAATAATTTCAAACTCATCCAT-3'94°C 4min94C变性反应lmin49。...
【专利技术属性】
技术研发人员：丁武，寇莉萍，刘变芳，张静，宋社果，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：87[中国|西安]
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