本发明专利技术整合了错配扩增突变分析PCR（MAMA-PCR）和多重PCR技术，提供了一种快速检测由于核苷酸点突变引起的耐喹诺酮类抗生素空肠弯曲杆菌的方法及试剂盒。本发明专利技术所提供的试剂盒包括具有序列表中SEQ?ID?№：1-5、SEQ?ID?№：7所示的核苷酸序列的引物组合物和具有序列表中SEQ?ID?№：1-6所示核苷酸序列的质控组引物组合物。本发明专利技术提供的检测方法及试剂盒可快速从疑似菌中鉴定出耐喹诺酮类抗生素的空肠弯曲杆菌，简化了以菌种鉴定和药敏试验为代表的传统检测方法的复杂程序，具有良好的特异性和灵敏度，非常适合基层一线用于快速检测疑似菌，继而提供准确的用药指导。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术整合了错配扩增突变分析PCR（MAMA-PCR）和多重PCR技术，提供了一种快速检测由于核苷酸点突变引起的耐喹诺酮类抗生素空肠弯曲杆菌的方法及试剂盒。本专利技术所提供的试剂盒包括具有序列表中SEQ?ID?№：1-5、SEQ?ID?№：7所示的核苷酸序列的引物组合物和具有序列表中SEQ?ID?№：1-6所示核苷酸序列的质控组引物组合物。本专利技术提供的检测方法及试剂盒可快速从疑似菌中鉴定出耐喹诺酮类抗生素的空肠弯曲杆菌，简化了以菌种鉴定和药敏试验为代表的传统检测方法的复杂程序，具有良好的特异性和灵敏度，非常适合基层一线用于快速检测疑似菌，继而提供准确的用药指导。【专利说明】—种检测耐喹诺酮类抗生素空肠弯曲杆菌的多重PCR方法及试剂盒
本专利技术属于生物
，具体涉及ー种快速检测耐喹诺酮类抗生素空肠弯曲杆菌的分子生物学技木 。
技术介绍
空肠弯曲杆菌是ー种主要的食源性感染病原菌，在许多经济发达国家由空肠弯曲杆菌感染引起的腹泻在细菌性腹泻病中位居榜首。在发展中国家，空肠弯曲杆菌引起的腹泻仅次于大肠杆菌和志贺氏菌。近年来，随着空肠弯曲杆菌耐药性的增强，使其在食物中污染程度增高，由其造成的食物中毒事件迅速増加。世界卫生组织(WTO)已将该病列为最常见的传染病之一，我国的国家食源性疾病监测网于2003年増加了对弯曲菌病的监测。在自然界中，空肠弯曲杆菌广泛存在于鸡，鸭，牛，羊等家禽，家畜以及鸟类的肠道内，构成空肠弯曲杆菌的体外储存宿主。空肠弯曲杆菌污染的肉，奶，蛋以及水源等是空肠弯曲杆菌感染的主要传染源。无论在动物体内还是在人类感染中，目前空肠弯曲杆菌的耐药问题世界性普遍存在，成为空肠弯曲杆菌病预防控制及临床治疗所面临的重要挑战。喹诺酮类药物是治疗空肠弯曲杆菌肠炎中使用最普遍的药，不幸的是90年代后随着其大量的应用，其耐药性迅速増加，耐药菌株也开始传播。不仅人类感染菌株中其耐药比例逐渐增加，在动物中，家畜，家禽及肉类食品分离菌株中，喹诺酮的耐药也逐渐增加。随着喹诺酮类抗性菌种造成感染数量的增多，人类感染空肠弯曲杆菌病例也越来越多。人们在肉用动物生产中使用了大量的喹诺酮类药物，使喹诺酮类药物在食物链中出现造成空肠弯曲杆菌对其产生耐药性。目前细菌耐药性检测主要是通过基于培养的药物敏感性实验，包括纸片扩散法、最小抑菌浓度(MIC)法等。其中MIC法属于金标准，可以表明细菌对药物的敏感性，从而指导临床治疗。由于上述药物敏感性实验是基于培养的，因此耗时较长，约2-3天才能获得结果，而且灵敏度较差，因此，临床亟需快速灵敏的实验方法来检测细菌耐药性，指导临床治疗方案，控制耐药细菌的传播和扩散。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了克服传统检测方法的缺陷，提供ー种简便、快捷、准确率高的检测耐喹诺酮类抗生素的空肠弯曲杆菌的引物组合物及方法，所述方法具体涉及ー种整合菌种鉴定多重PCR技术和MAMA-PCR技术的分子生物学方法。本专利技术提供的ー种用于辅助鉴别待测空肠弯曲杆菌是否耐喹诺酮类抗生素的引物对，由如下I)和2)所述引物组成:I)具有序列表中SEQ ID No:5所不的核昔酸序列；2)具有序列表中SEQ ID Na:7所示的核苷酸序列。本专利技术提供的另ー种用于辅助鉴别待测空肠弯曲杆菌是否耐喹诺酮类抗生素的引物组合物，由如下所述引物组成:具有序列表中SEQ ID N2:1、所示核苷酸序列的引物、具有序列表中SEQ ID Na:2所示核苷酸序列的引物、具有序列表中SEQ ID Na:3所示核苷酸序列的引物、具有序列表中SEQ ID N2:4所示核苷酸序列的引物、具有序列表中SEQ IDNs:5所示核苷酸序列的引物和具有序列表中SEQ ID N2:7所示核苷酸序列的引物。本专利技术提供的再一种用于辅助鉴别待测空肠弯曲杆菌是否耐喹诺酮类抗生素的引物组合物，由检测组引物组合物和质控组引物组合物组成；所述检测组引物组合物由如下所述引物组成:具有序列表中SEQ ID N2:l、所示核苷酸序列的引物、具有序列表中SEQ ID N2:2所示核苷酸序列的引物、具有序列表中SEQID N2:3所示核苷酸序列的引物、具有序列表中SEQ ID N2:4所示核苷酸序列的引物、具有序列表中SEQ ID N2:5所示核苷酸序列的引物和具有序列表中SEQ ID N2:7所示核苷酸序列的引物；所述质控组引物组合物由如下引物组成:具有序列表中SEQ ID N2:1、所示核苷酸序列的引物、具有序列表中SEQ ID N2:2所示核苷酸序列的引物、具有序列表中SEQ IDNs:3所示核苷酸序列的引物、具有序列表中SEQ ID N2:4所示核苷酸序列的引物、具有序列表中SEQ ID N2:5所示核苷酸序列的引物和具有序列表中SEQ ID N2:6所示核苷酸序列的引物。本专利技术的另一个目的是提供一种用于辅助鉴别待测空肠弯曲杆菌是否耐喹诺酮类抗生素的试剂盒，所述试剂盒包括上述任一所述的引物对或引物组合物。本专利技术的还一个目的是提供一种用于辅助鉴别待测空肠弯曲杆菌是否耐喹诺酮类抗生素的PCR试剂，包括检测PCR试剂和质控PCR试剂，其中检测PCR试剂包括如下引物组合物:具有序列表中SEQ I D Na:1-5和SEQ ID Na:7所示核苷酸序列的引物组合物；质控PCR试剂包括具有序列表中SEQ ID N2:1-6所示核苷酸序列的引物组合物。所述检测PCR试剂中，所述具有序列表中SEQ ID Na: 1-2,SEQ ID Ns:5和SEQ IDNa:7的引物与所述具有序列表中SEQ ID Na:3_4的引物的摩尔比为4:3 ;所述质控PCR试剂中，所述具有序列表中SEQ ID Na:1-2, SEQ ID Na:5~6的引物与所述具有序列表中SEQID Na:3-4的引物的摩尔比为4:3。本专利技术的还一个目的是提供上述任一所述引物对或引物组合物、所述试剂盒、或所述试剂在制备辅助鉴别待测空肠弯曲杆菌是否耐喹诺酮类抗生素的产品中的应用。本专利技术的还一个目的是提供上述任一所述引物对或引物组合物、所述试剂盒、或所述试剂在制备待测空肠弯曲杆菌是否发生突变的产品中的应用。所述突变为待测空肠弯曲杆菌基因组gyrA基因中第257位核苷酸(从起始密码子的第一个碱基开始计算)由C突变为T。本专利技术的再一个目的是提供一种辅助鉴别待测空肠弯曲杆菌是否耐喹诺酮类抗生素的方法，包括如下步骤:以待测空肠弯曲杆的基因组DNA为模板，使用上述任一所述的引物对或引物组合物、上述任一所述的试剂盒或PCR试剂，进行PCR扩增。所述方法中，所述PCR扩增条件为:94 V 3min, I循环；94 V 30s,56 V 30s、72°C 40s，共计30个循环。所述方法中，所述PCR扩增结果通过凝胶电泳检测；所述凝胶电泳检测条件为IlOV电压，电泳50min ;所述凝胶电泳采用体积百分比为2.5%浓度的琼脂糖凝胶。所述耐喹诺酮类抗生素空肠弯曲杆菌具体指空肠弯曲杆菌基因组gyrA基因中的第257位(从起始密码子的第一个碱基开始计算)核苷酸由C突变为T。所述方法还包括鉴别待测空肠弯曲杆菌是否耐喹诺酮类抗生素的判断标准:当利用所述检测组引物组合物可扩增出358bp、134bp和180bp大小的核酸片段；同时，利用所述本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于辅助鉴别待测空肠弯曲杆菌是否耐喹诺酮类抗生素的引物对，由如下1）和2）所述引物组成：1）具有序列表中SEQ?ID?№：5所示的核苷酸序列；2）具有序列表中SEQ?ID?№：7所示的核苷酸序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：汪洋，吴聪明，吴辰斌，沈建忠，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：
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