本发明专利技术公开了一种空肠弯曲杆菌和沙门氏菌的磁捕获-双重实时荧光PCR检测的方法，该方法利用抗血清和磁性微珠制备空肠弯曲杆菌和沙门氏菌免疫磁珠，利用免疫磁珠直接捕获检样中目的菌，无需增菌培养；本发明专利技术利用双重实时荧光PCR方法，分别设计空肠弯曲杆菌和沙门氏菌的保守基因的特异性引物和检测探针，通过一次实时荧光PCR扩增来判断样品中是否受空肠弯曲杆菌和沙门氏菌的污染；本发明专利技术方法简便易行，可在一个工作日内完成，特异性好，敏感度高，是一种适用于检验检疫、疾病预防和动物产品安全检验等领域的快速技术方法。
【技术实现步骤摘要】
空肠弯曲杆菌和沙门氏菌的磁捕获-双重实时荧光PCR检测方法
本专利技术属于检验检疫领域，涉及双重实时荧光PCR检测方法，具体涉及一种应用免疫磁珠技术进行空肠弯曲杆菌和沙门氏菌的磁捕获-双重实时荧光PCR检测的方法。
技术介绍
空肠弯曲杆菌和沙门氏菌是引起细菌性食物中毒的常见致病菌，常污染肉、乳和禽等动物性食品，食用污染的食品可引起腹泻、呕吐等急性肠胃炎症状，严重的可引起死亡。空肠弯曲杆菌是近十几年来被认识的世界范围广泛流行的人兽共患病原菌，世界卫生组织已将该病列为最常见的食源性传染病之一。空肠弯曲杆菌的感染还与人的格林-巴利综合症等具有自身免疫特性的疾病有关(McCarthy N, Giesecke J, Weinberg E D, etal.1ncidence of GuillainBarre Syndro me following infection with Campylobacterjejuni [J], Am J Epidemiol, 2001，153(6): 610-614)。据我国和世界各国的统计资料表明，沙门氏菌引发的食物中毒在细菌性食物中毒中占据首位，现已成为食品公共卫生方面的重要问题。空肠弯曲杆菌和沙门氏菌感染的初期症状非常类似，这对区分两种疾病造成了困难。对空肠弯曲杆菌和沙门氏菌的检测，传统的培养方法包括增菌、生理生化鉴定、血清学鉴定等操作，但是所需检验时间长而且病原菌在食品样品中存在的数量相对较少，使用常规选择性平板上挑取可疑菌落的方法也可能会造成阳性菌株的漏检。空肠弯曲杆菌属于微需氧菌，对培养基及培养气体环境要求都比较严格，而且细菌的分离培养费时费力，当感染或污染的量较少时，从样品中分离出空肠弯曲杆菌就更加困难。据报道，空肠弯曲杆菌的致病剂量很小，400个~500个菌体就可引发肠道感染(Mandell GL, Bennett JE, Dolin, etal.Principles and practice of infectious diseases 4th edition [M].New YorkChurchill Livingstone, 1995, 2053 - 2060.),因此建立高灵敏度和高特异度的检测方法是提高空肠弯曲杆菌检出率的重要措施。此外，该菌通过动物带菌者或患病者的粪便进入环境中，可在水环境中进入一种“活的非可培养”(viable but non-cuIturerabIe,VBNC)状态(Mckay A M.Viable but non-culturabIe forms of potentially pathogenicbacteria in water [J].Lett Appl Microbiol, 1992, 14: 129-135.Medema G J,Schets F M, Van de Giessen A ff, et al.Lack of colonization of I day old chicksby viable, non-culturable Campylobacter jejuni [J].J Appl Bacteriol, 1992, 75:512-516.)，处于VBNC状态的细菌在特定条件下可以复苏且具有致病性。这更是传统分离培养检测方法无法克服的难题。因此在空肠弯曲杆菌的检验检疫工作中急需一种灵敏的快速检测方法。一些简单的方法如PCR、ELISA往往有较高的假阳性结果出现，因此其结果都不能作为最终的检测依据。随着分子生物学技术快速发展，实时荧光PCR技术广泛应用于病原微生物检测。在实时荧光PCR反应中，引入了一种荧光化学物质，对PCR产物进行标记跟踪。随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累积，荧光信号强度也等比例增加。即每经过一个循环，荧光监测系统可收集一个荧光强度信号，从而实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步，实时在线监控反应全过程。从而通过荧光强度变化监测产物量的变化，得到一条荧光扩增曲线图，然后还可以结合相应的软件对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。同常规PCR相比，实时荧光PCR具有特异性更强、能有效解决PCR污染、自动化程度高及实现PCR反应的实时监控等优点，目前已得到广泛应用。1979年，JohnUgelstad等成功地制备了一种均匀性和粒度适宜的聚苯乙烯微球，将其磁化并与抗体连接后，成为一种分离细胞效果极佳的免疫磁珠一Dynabeads。从此，免疫磁珠得到广泛应用，并引发了生物分离技术上的一次革命。免疫磁珠技术(immunomagnetic beads techniques, I MB)是一种利用经过修饰的磁性微球作为载体进行目标物捕获及富集的技术。该技术的关键点是特异性的免疫磁珠的制备。磁珠经过一定处理后，可结合某种微生物的特异性抗体，形成免疫磁珠，将这种带有特异性抗体的免疫磁珠加到待测样品中，相应的抗原物质就会和免疫磁珠上的抗体发生特异性结合，形成抗原-抗体-磁珠免疫复合物。这种复合物在较强的外加磁场作用下发生力学移动，使复合物与其他物质分离，从而达到快速分离抗原物质的目的。然后，撤去磁场，收集磁珠，将抗原物质从磁珠上解离下来对其进行鉴定，或直接进行PCR或荧光染色等检验。近年来该技术被广泛应用于生化产品的分离纯化及微生物检测领域等，尤其在病原微生物分离检测方面的应用日益广泛，已研制出了针对不同病原菌的商品化免疫磁珠检测试剂盒，并逐步应用到实验室的相关检测工作中。
技术实现思路
本专利技术结合免疫磁珠技术和双重实时荧光PCR技术，首次建立了一种空肠弯曲杆菌和沙门氏菌的磁捕获-双重实时荧 光PCR检测方法，为实现空肠弯曲杆菌和沙门氏菌的同时检测提供新方法。本专利技术的目的在于提供一种空肠弯曲杆菌和沙门氏菌的磁捕获-双重实时突光PCR检测方法。本专利技术所采取的技术方案是: 空肠弯曲杆菌和沙门氏菌的磁捕获-双重实时荧光PCR检测方法，包括以下步骤: (1)免疫磁珠的制备: O分别制取沙门氏菌抗体和空肠弯曲杆菌抗体； 2)将磁珠分别与上述沙门氏菌抗体和空肠弯曲杆菌抗体进行振荡孵育，使抗体与磁珠充分结合； 3)将孵育的磁珠洗涤干净，4°C保存，即可分别获得沙门氏菌和空肠弯曲杆菌的免疫磁珠; (2)目的菌的磁捕获 1)将待检样品离心，弃上清，沉淀重悬于含BSA的PBS缓冲液中； 2)取上述待检悬液加入含空肠弯曲杆菌免疫磁珠和沙门氏菌免疫磁珠悬液的试管中，室温振荡孵育使目的菌与免疫磁珠结合完全，弃去液体；再加入含BSA的PBS缓冲液将结合有目的菌的免疫磁珠清洗干净；3)将上述洗涤干净的免疫磁珠加入去离子水混匀，用于提取细菌DNA ； (3)双重实时荧光PCR: 1)细菌DNA模板的制备:将上述捕获有目的菌的磁珠于95~100°C裂解，冰浴10~15min，然后经离心取上清液，即为模板DNA ； 2)将上述获得的模板DNA进行双重实时荧光PCR反应，反应体系为: 2.5 XRealMasterMix (含内参染料 ROX) 8 μ L, 引物 F-1 (10μΜ)IuL 引物 R-1 (10μΜ)IuL 引物 F-2 (10μΜ)IuL 引物 R-2 (10μΜ)I本文档来自技高网...
【技术保护点】
空肠弯曲杆菌和沙门氏菌的磁捕获‑双重实时荧光PCR检测方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）免疫磁珠的制备：1）分别制取沙门氏菌抗体和空肠弯曲杆菌抗体；2）将磁珠分别与上述沙门氏菌抗体和空肠弯曲杆菌抗体进行振荡孵育，使抗体与磁珠充分结合；3）将孵育的磁珠洗涤干净，4℃保存，即可分别获得沙门氏菌和空肠弯曲杆菌的免疫磁珠；（2）目的菌的磁捕获 1）将待检样品离心，弃上清，沉淀重悬于含BSA的 PBS缓冲液中；2）取上述待检悬液加入含空肠弯曲杆菌免疫磁珠和沙门氏菌免疫磁珠悬液的试管中，室温振荡孵育使目的菌与免疫磁珠结合完全，弃去液体；再加入含BSA的 PBS缓冲液将结合有目的菌的免疫磁珠清洗干净；3）将上述洗涤干净的免疫磁珠加入去离子水混匀，用于提取细菌DNA；（3）双重实时荧光PCR：1）细菌DNA模板的制备：将上述捕获有目的菌的磁珠于95～100 ℃裂解，冰浴10～15min，然后经离心取上清液，即为模板DNA；2）将上述获得的模板DNA进行双重实时荧光PCR反应，反应体系为：2.5 ×RealMasterMix (含内参染料ROX) 8μL，引物F‑1（10μM） 1μL引物R‑1（10μM） 1μL引物F‑2（10μM） 1μL引物R‑2（10μM） 1μL检测探针‑1（10μM） 0.3μL检测探针‑2（10μM） 0.7μL20 ×probe Enhancer solution 1μL模板DNA 2μLddH2O 补至20μL；其中，引物F‑1、引物R‑1、检测探针‑1为空肠弯曲杆菌实时荧光PCR检测的引物和探针，其序列如下：引物F‑1： 5' TGCTGAAGAGGGTTTGGGT‑3'引物R‑1：5' ACCCCTTCCAATAACTTCAATACT‑3'检测探针‑1：5' FAM TCCGAAGAAGCCATCATCGCACC TAMRA‑3'空肠弯曲杆菌检测探针序列的5'端标记有荧光报告基团FAM，3'端标记有荧光淬灭基团TAMRA；引物F‑2、引物R‑2、检测探针‑2为沙门氏菌实时荧光PCR检测的引物和探针，其序列如下：引物F‑2：5'‑ATTTGTATTGGTTGTTACGGCTATT‑3' 引物R‑2：5' ‑TGCTCGCCTTTGCTGGTT‑3'检测探针‑2：5'JOE ‑TTCAATGGGAACTCTGCCGGGATT‑TAMRA3'沙门氏菌检测探针序列的5'端标记有荧光报告基团JOE，3'端标记有荧光淬灭基团TAMRA；3）结果分析和判定：反应结束后，调整阈值，观察阴性对照品，其FAM、JOE荧光信号值没有明显变化、扩增Ct值不存在或在40以上，可判定该次实验可靠；检测样品中，若FAM荧光收集信号呈S型扩增曲线且Ct值<35，则该样品为空肠弯曲杆菌阳性，若35<Ct值<40，则该样品重做；若Ct值>40，则该样品为空肠弯曲杆菌阴性；检测样品中，若JOE荧光收集信号呈S型扩增曲线且Ct值<35，则为沙门氏菌阳性，若35<Ct值<40，则该样品重做；若Ct值>40，则为沙门氏菌阴性。...
【技术特征摘要】
1.空肠弯曲杆菌和沙门氏菌的磁捕获-双重实时荧光PCR检测方法，其特征在于:包括以下步骤: (1)免疫磁珠的制备: 1)分别制取沙门氏菌抗体和空肠弯曲杆菌抗体； 2)将磁珠分别与上述沙门氏菌抗体和空肠弯曲杆菌抗体进行振荡孵育，使抗体与磁珠充分结合； 3)将孵育的磁珠洗涤干净，4°C保存，即可分别获得沙门氏菌和空肠弯曲杆菌的免疫磁珠; (2)目的菌的磁捕获 1)将待检样品离心，弃上清，沉淀重悬于含BSA的PBS缓冲液中； 2)取上述待检悬液 加入含空肠弯曲杆菌免疫磁珠和沙门氏菌免疫磁珠悬液的试管中，室温振荡孵育使目的菌与免疫磁珠结合完全，弃去液体；再加入含BSA的PBS缓冲液将结合有目的菌的免疫磁珠清洗干净； 3)将上述洗涤干净的免疫磁珠加入去离子水混匀，用于提取细菌DNA； (3)双重实时荧光PCR: 1)细菌DNA模板的制备:将上述捕获有目的菌的磁珠于95~100°C裂解，冰浴10~15min，然后经离心取上清液，即为模板DNA ； 2)将上述获得的模板DNA进行双重实时荧光PCR反应，反应体系为: .2.5 XRealMasterMix (含内参染料 ROX) 8 μ L, 引物 F-1 (10μΜ)1uL 引物 R-1 (10μΜ)1uL 引物 F-2 (10μΜ)1uL 引物 R-2 (10μΜ)1μ L 检测探针-1 (10μΜ)0.3μ L 检测探针-2 (10μΜ)0.7μ L . 20 Xprobe Enhancer solutionIuL 模板DNA2 μ L ddH20补至 20 μ L ; 其中，引物F-1、引物R-1、检测探针-1为空肠弯曲杆菌实时荧光PCR检测的引物和探针，其序列如下:引物 F-1: 5’ TGCTGAAGAGGGTTTGGGT-3'引...
【专利技术属性】
技术研发人员：罗开健，高瑞娟，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东;44
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