一种重组大肠杆菌Taq DNA聚合酶的纯化方法技术

本发明专利技术公开了一种重组大肠杆菌Taq DNA聚合酶的纯化方法，包括以下步骤：(1)破菌；(2)热处理；(3)盐析；(4)Ni离子金属螯合亲和层析；(5)透析；(6)制剂分装。工艺简便、快速，获得的重组大肠杆菌Taq酶质量高、成本低、十分适合工业放大生产。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
一种重组大肠杆菌Taq DNA聚合酶的纯化方法，其特征在于：由以下步骤组成：（1）破菌 离心获得表达重组大肠杆菌Taq DNA聚合酶的菌体，以1: 5～20比例加入破菌缓冲液，搅拌10～20 min使之混合均匀，通过超声或高压均质的方法裂解菌体，使之破碎；其中破菌缓冲液为20～50 mM Tris‑HCl，pH7.5～8.5，0.1～5 mM EDTA，0.1～1 M KCl，0.1‑1% Tween‑20，0.1‑1% NP‑40，溶菌酶0.5～2 mg/ml，加入PMSF至0.02～1 mM，破菌时以菌液不再粘稠、流动性良好为准，破菌液10000～20000 g离心，时间10～20 min，离心温度控制在0～10 ℃，所述破菌步骤中破菌法选自高压均质法，是指将菌体和破菌缓冲液的混合液放入高压均质机中，在0～10 ℃、工作压力为500～800 bar时均质2～3遍，所述破菌步骤也可以采用超声法，方法为放入超声设备中，超声5～10 s，停10～20 s，共超声10～20 min，此超声方法建议体积小于0.5 L时使用;（2）热处理：先将水浴锅加热到70～90 ℃，将破菌离心上清液装入一玻璃容器中一并放入预先加热好的水浴锅中，在加热升温过程需不停的搅拌上清液，避免容器内局部温度过高，从而影响酶的活性，热处理时间是20～60 min，当破菌上清液温度达到70～90 ℃时开始计时，热处理后会有很多不耐热蛋白变性析出，将其放入4 ℃冰箱中降至室温以下后方可进行离心，否则温度过高会导致离心杯变形，离心力控制在10000～20000 g，时间10～20 min，温度0～10 ℃；（3）盐析：盐析的饱和度为40～60%，经研究40%以上盐析浓度，导致目的蛋白收率轻微下降，对后续纯化纯度没有影响，具体操作为：事先将硫酸铵盐用研钵研碎，向破菌上清液中一次性加入，搅拌至完全溶解，确保不会出现局部浓度过高，100 ml破菌上清液加入22.6～36.1 g硫酸铵，沉淀温度控制在0～10 ℃，沉淀时间为大于2 h，10000～20000 g离心时间10～20 min，离心温度控制在0～10 ℃，离心沉淀按金属螯合层析每批处理量分装并冷冻保存；（4）金属螯合层析：金属螯合层析用缓冲液 I平衡色谱柱3～5 CV，上样后冲洗约5～10 CV，UV280洗至基线，从缓冲液 I到缓冲液 II洗脱目的蛋白5～25 CV/5～25 min，收集UV280大于100 mAu组分，其中缓冲液I为20～50 mM Tris‑HCl，pH7.0～8.0，0.5～1 M NaCl，5～10 mM咪唑，缓冲液II为20～50 mM Tris‑HCl，pH7.0～8.0，0.5～1 M NaCl，300～600 mM咪唑;通过优化缓冲液成分和洗脱方法,实现了目的蛋白与杂质最大程度的分离，所述金属螯合亲和层析步骤中介质配基为亚氨基二乙酸或次氮基三乙酸，优选为亚氨基二乙酸,由于次氮基三乙酸的载量相对较低，所以使用亚氨基二乙酸更经济，GE公司生产的Ni Sepharose HP、Ni Sepharose FF可重复使用，Ni离子脱落较少，选择性高，广泛用于组氨酸标签蛋白的纯化，其中Ni Sepharose HP填料颗粒平均34μm,分辨率略高于Ni Sepharose FF，且流速反压与Ni Sepharose FF无明显差异，对纯度要求较高时使用Ni Sepharose HP较理想，反之使用Ni Sepharose FF即可，同时可以降低成本;（5）质检、制剂及分装:金属螯合层析收集样品，加入等体积甘油‑20 ℃暂时保存，Bradford法检测蛋白浓度，利用NEB公司的Taq DNA聚合酶活测定方法检测蛋白活性，计算比活，按照NEB公司的Taq DNA聚合酶的DNA内切酶检测方法对我们的终产品进行检测，SDS‑PAGE检测蛋白纯度,在百级层流下，根据需要的酶活性加入稀释缓冲液进行蛋白浓度稀释，稀释缓冲液为1倍的NEB公司的酶储液缓冲液，成分为20 mM Tris‑HCl (pH8.0，25℃)、100 mM KCl、0.1 mM EDTA、1 mM DTT、0.5% Tween20、 0.5% NP‑40、50%甘油，稀释过程中温度维持在0～10 ℃，稀释样品0.22 µm无菌滤膜过滤，无菌连续分液器在百级层流下进行分装，分装过程中温度维持在0～10 ℃，分装用离心管经灭菌处理，样品‑20 ℃冻存。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张涛，田方，郑春阳，
申请(专利权)人：天津强微特生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：天津;12