抗家禽大肠杆菌败血症疫苗的制备方法技术

本发明专利技术涉及一些有效地保护家禽抵抗大物杆菌败血症的疫苗，它们含有Ｆ１１型菌毛或其致免疫部分，或能够引起Ｆ１１菌毛及其免疫部分的产生，或含有抗这些物质的抗体。（*该技术在2008年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及保护家禽抗大肠杆菌败血症的疫苗，以及通过投与这种疫苗而抵抗家禽大肠杆菌败血症的方法。大肠杆菌败血症或大肠杆菌病是一种通常发生于家禽(如小鸡和火鸡)中的疾病，它带来许多重大损失。患有这种疾病的鸟的特征性症状是肺泡炎、心包炎以及肝周炎。对该领域进行的大部分研究表明，在所说的病鸟中遇到的大肠杆菌株有一半以上属于下列三种血清型之一01∶K1，02∶K1，或078∶K80。在美国，也经常遇到血清型035。通常认为，大肠杆菌败血症是继发感染，它是在呼吸道被引起呼吸道疾病的病毒或支原体损伤后，通过它而进入机体的。对于在家禽大肠杆菌病的发病过程中发挥作用的致病因素几乎不了解。在哺乳动物的感染中发挥作用的大肠杆菌菌株的致病因素包括，例如，粘附菌毛、毒素和铁螯合机制。许多通常具有高度宿主特异性的不同粘附菌毛已被描述。在腹泻的病人中遇到过CFA菌毛，在腹泻的小猪中遇到过K88菌毛，在腹泻的绵羊、牛犊和小猪中遇到过K99，在尿道感染的人中遇到过P菌毛(包括F11型的菌毛)。另外，也已发现，投与作为疫苗的纯化型所说类型粘附菌毛，在相应类型的动物中产生了保护性免疫应答。但是，对于家禽大肠杆菌病的类似致病因素还未被鉴定。现已发现一种保护家禽抗大肠杆菌败血症的疫苗。其特征在于，它含有F11型的菌毛或其免疫部分，或含有具有遗传物质的生物体，这种遗传物质为所说的菌毛或其免疫部分的产物以及可能存在的排泄物编码。尤其是，通过研究已可能表明，从患有大肠杆菌病的小鸡的受影响心脏分离出的大肠杆菌菌株产生出与F11型的菌毛相同的菌毛，此种菌毛也存在于引起人尿道感染的大肠杆菌菌株中。通过血清学可能证明，绝大多数患有大肠杆菌败血症的鸟类是被含有F11型菌毛的大肠杆菌感染的。按照SDS-PAGE，这些菌毛含有表现分子量为18.0KD的亚单位蛋白质。它们可被在37℃培养的固体琼脂培养基上的野生鸟的大肠杆菌菌株产生。但如果大肠杆菌是培养在肉汤中，则未被发现。如果细菌是培养在血琼脂(基质)板(如Oxoid制造的)上，则进行18KD菌毛的最佳表达。Peuassay琼脂板(Difco)也是合适的培养基。在20℃生长时不形成18KD菌毛。过去已从野生型尿路病原体的大肠杆菌菌株中克隆F11菌毛(见deRec，J.M.等，FEMSMicrobiologyLett.29，91-97，1985)。用含有为F11菌毛编码的基因的pPLL291-15质粒转化无菌毛大肠杆菌K12菌株AM1727，该转化菌株就能够产生F11菌毛。现已按下列参数，将所说的F11菌毛与从大肠杆菌CH4菌株纯化的18KD菌毛进行了比较，该菌株属于经常出现于鸟类中的02∶K1∶H血清型。a.形态学在电子显微镜下，F11和18KD菌毛表现相同其菌毛大约都是1μm长，但其直径大约都是7nm。b.分子量通过SDS-PAGE发现，F11和18KD菌毛亚单位的表现分子量均为18KD。c.免疫化学特异性在酶联免疫吸附检测(ELISA)中，F11和18KD菌毛同样地与抗F11单克隆抗体反应(见J.Clin.Aicrobiol.24，121-125;1986，deRee.J.M.等)，而不与抗FIA、FIC、F7、F72、F8、F9、F12或F13型的菌毛的单克隆抗体反应。d.氨基酸组成18KD亚单位的氨基酸组成与F11亚单位的组成基本相同(VanDie，I等;D.L.Lark(ed.)，Proteincarbohydrateinteractionsinbiologicalsystems，Academicpress，London，pages38-46，1986)(见表1)。表1F11和18KD菌毛亚单位氨基酸组成的比较氨基酸 F111)18KD2)Asx1818.6Thr1415.3Ser1211.0Glx1716.5Gly2019.6Ala1920.2Val1312.2Ile65.8Leu1010.3Tyr32.2Phe87.7Lys1110.1Arg00.9His11.4Met1Cys2Pro66.6Total1611611)按照氨基酸序列(见附图说明图1)计算2)在6NHCl中水解后，使用ultrapac8柱(LKB)通过SODIUM系统测定。e.氨基末端的氨基酸序列18KD亚单位的氨基末端的前17个氨基酸的序列与已知的F11亚单位的对应序列相同(VanDie，I.et.al.;1986)-图1表示了整个F11亚单位蛋白质的氨基酸序列。实际分子量16.4KD可从其序列计算。P菌毛的粘附特性，家F11一样，可通过人红血球甘露糖抗性血凝反应(MRHA)而被观察到。这种甘露糖抗性血凝反应可通过在甘露糖存在的情况下，将表达足够量所说P菌毛的大肠杆菌与人红血球混合而显示。足够P菌毛粘附于人红血球的最小受体结构已被鉴定为二糖Galα1→4Galβ(Kallenius，G.等，Lancetⅱ.604-6;1981)。这种二糖与乳胶颗粒偶联产生一种工具，它通过乳胶凝聚而特异性地证明细菌上的P菌毛(deMan，P.等，J.Clin.Microbiol.25，401-6;1987)。最近已表明，负责粘附的不是F11菌毛本身，而是与菌毛相关的特定粘附蛋白(也称作“微成分”)(VanDie，I.等，MicrobiolPathogenesis1，51-56;1986)。表2显示了F11菌毛的表达与尿路病原性大肠杆菌菌株的吸附特性的相互关系，比较了产生F11菌毛的重组克隆和一些从患有大肠杆菌病的小鸡的受害心脏分离出的大肠杆菌菌株。从这一表中得知，从小鸡中分离出的大肠杆菌的F11菌毛至少象人大肠杆菌的F11菌毛一样识别同样的受体。表2F11菌毛的表达，血凝反应及P-受体识别菌株数a)在下列检测中测得的在下列试验中测得的(血清型)F11菌毛的表达粘附ELISAb)Westernc)MRHA P-受体印迹试验d)试验e)H291(01∶K1)＞4.7+++++++AM1727----AM1727/pPIL291-15＞4.7+++++++++++CH2(078∶K80)3.0+++CH4(02∶K1)＞4.7++++++CH5(02∶K1)2.7---CH6(01∶K1)＞4.7++++++CH7(015∶K14)----CH96(078∶K80)3.2++++CH139(02∶K1)＜4.7++++++++a)H291为人大肠杆菌，F11参照菌株C1976;AM1727/pPIL291-15为少菌毛K12菌株AM1727的产生F11菌毛的重组克隆;b)用抗F11血清进行的整个细菌酶联免疫吸附检测;10log滴度被定为具有至少两倍于本底值的A540值的最高血清稀释度。c)带有抗F11血清的粗菌毛制品的Western印迹。d)用人红血球进行的甘露糖抗性血凝反应。e)被Galαl→4Galβ包裹的乳胶颗粒的凝聚。符号的含义-在上面提到的试验中无反应性;+→++++在上面提到的试验中反应程度的逐级增加。本专利技术的疫苗也可能含有，与F11菌毛一起或取代F11菌毛，F11菌毛的致免疫部分。这种致免疫部分可被理解为意味着18KD亚单位，其聚集物，或其片断或为F11菌毛、其聚集物或片段所特有的粘附蛋白。18KD亚单位的这一片联或所本文档来自技高网...

【技术保护点】
保护家禽抗大肠杆菌败血症的疫苗，其特征在于所说的疫苗含有Ｆ１１型菌毛，或其致免疫部分，或者是具有遗传物质的生物体，这些遗传物质为所说的菌毛或其致免疫部分的产生以及选择性分泌编码。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：约翰弗兰西斯科凡登布什，
申请(专利权)人：阿克佐公司，
类型：发明
国别省市：NL[荷兰]