一种小麦花粉管转基因育种方法技术

本发明专利技术属于遗传育种技术领域，具体涉及一种改进后的小麦花粉管转基因育种方法。该方法包括：将含目标基因的表达质粒转化、获得重组菌株、利用玻璃珠悬起菌落法快速提取质粒、利用花粉管通道法转化受体小麦、筛选、鉴定等步骤。本发明专利技术所提供的小麦花粉管转基因方法，通过对质粒提取方法的优化，大大提高了获得大量质粒的效率，且降低了成本，从而为花粉管通道法在小花农作物如小麦中的大规模应用奠定了基础。相较于现有的花粉管通道法在小麦转基因育种中的应用，本发明专利技术中质粒提取便捷、快速，成本低廉，且省工省时，能够较好提高工作效率，因而对于小麦新品种的培育具有较好地促进作用。

【技术实现步骤摘要】
一种小麦花粉管转基因育种方法
本专利技术属于遗传育种
，具体涉及一种改进后的小麦花粉管转基因育种方法。
技术介绍
关于花粉管通道，王艳杰等人（花粉管通道法转基因技术的细胞胚胎学机理探讨，西北植物学报，2006，26(3)：0628-0634）认为，花粉管通道是花粉管在相关组织中生长时，将周围组织的细胞挤压，从而使花粉管与相应组织的细胞之间形成的缝隙。花粉管通道法（pollen-tubepathway）就是将供体生物的DNA片段，在受体自花授粉后一定时期，使其沿着花粉管的通道进入胚囊转化受精卵或其前后的细胞（卵细胞和早期胚细胞）而自然发展成种子。花粉管通道法自创立以来，在玉米、水稻、棉花等多种农作物育种上取得了显著成绩，因为该法是外源DNA或单基因导入植物简便有效的途径，其成本低廉，因而尤其适合我国广大育种工作者作为育种的新方法，在国内得到了较为快速的推广和发展。关于花粉管通道法，现有研究一般认为，其主要优势有以下几点：（1）可直接得到转化种子，不依赖植物组织培养或诱导再生植株等一整套人工培养过程，一般不会形成嵌合体，纯合速度快；（2）由于花粉管通道是天然存在的普通现象，故利用花粉管通道法进行外源基因的遗传转化，可基本上应用于任何开花植物，进行任何物种之间包括人工合成基因的转移，从而极大的扩大了基因工程的目的基因的来源和受体植物的范围；（3）操作简便、经济，易于常规育种者掌握，适合大规模的农作物遗传转化；由于直接获得转基因植株，在进行转基因目标性状和转基因分子鉴定的同时，即可针对转基因植株的农艺性状进行定向筛选，故能够与转基因育种直接结合，使形成转基因农作物新品种的效率得到提高，育种周期大幅缩短；（4）转化频率高，效果好，变异广泛，为育种提供了大量有价值的种质资源；（5）该方法利用了整体植株的卵细胞、受精卵或早期胚胎细胞进行转化，直接获得的产品即是转基因植株；因此，在转基因表达的目标性状鉴定上，完全可以直接针对目标性状的表现型进行，从而避免在植物组培的鉴定过程中，大量依赖抗生素进行筛选的弊端。但是，花粉管通道法也有一些较为明显的缺陷，主要有如下几点：（1）进行外源基因转化目标植物的工作时间受自然花期限制，同时必须充分了解每一种植物的开花受精的时间和过程；（2）花粉管通道法操作的经验性较强，需要一定的技术摸索和技巧；（3）对单籽粒的小花农作物操作难度较大，需要大量的、浓度高的质粒，工作量大，成本高，限制其在生产上的规模化应用。由于上述缺陷，因而一定程度上严重的限制了花粉管通道法在转基因育种尤其是小花植物（例如小麦）育种中的大规模应用，本专利技术系统化了小麦花粉管转基因的方法，并对质粒提取方法进行改进，提取质粒浓度高且成本低，并成功把外源质粒导入小麦中。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种改进后的小麦花粉管转基因育种方法，从而为花粉管通道法在农作物分子育种中的应用提供借鉴和参考。本专利技术所采取的详细技术方案如下所述。一种小麦花粉管转基因育种方法，包括以下步骤：（1）采用热击法将含目标基因的表达质粒转入大肠杆菌感受态细胞，进行热激转化，转化后加入培养液进行抗性筛选，获得重组后菌株；（2）采用玻璃珠悬起菌落法快速提取质粒，具体过程为：首先，将步骤（1）中筛选所得重组菌株接种于含有抗性抗生素的平板培养基上，进行培养；其次，在平板上加入无菌水和灭菌的玻璃珠摇晃，利用玻璃珠悬起菌落，并将含有菌落的无菌水进行离心，保留沉淀细胞；最后，将沉淀细胞进行裂解，利用氯仿-异戊醇混合液，离心提取质粒；（3）利用花粉管通道法转化受体小麦，具体为：在小麦开花前，按照常规杂交育种的方法进行整穗、去雄、套袋；在去雄2~3天后，人工授粉；在小麦授粉1.5~2h后剪去约三分之一的柱头，然后在剪切后的柱头上滴加步骤（2）中所提取的质粒；每个柱头的上质粒的滴加量具体可设计为：100μg/mL、10μL；优选情况下，在柱头上初次滴加质粒后1h重复滴加一次；滴加质粒后，套袋，做好标记，继续培育，自然结实后收获小麦种子，对所收获的小麦的种子进一步培育、筛选获得相应的转基因植株。本专利技术所提供的小麦花粉管转基因方法，通过对质粒提取方法的优化，大大提高了获得大量质粒的效率，从而为花粉管通道法在小花农作物如小麦中的大规模应用奠定了基础。相较于现有的花粉管通道法在小麦转基因育种中的应用，本专利技术中质粒提取便捷、快速，成本低廉，且省工省时，能够较好提高工作效率，因而对于小麦新品种的培育具有较好地促进作用。附图说明图1为100mg/L的潮霉素涂抹筛选，上图中是表现潮霉素抗性，下图中是没有表现潮霉素抗性；图2为转化植株Tri101基因PCR鉴定；其中泳道M:DNAMarkerDL2000；泳道1-13:样品；泳道14:pCAMBIA1301S空载体对照；泳道15:阳性对照；泳道16:阴性对照；泳道17:空白对照（水）；图3为转化植株GUS染色鉴定，其中A为阳性植株，B为阴性植株。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术做进一步的解释说明。介绍具体实施例前，对本专利技术中涉及的部分物料及试验设备情况简要介绍说明如下。生物材料：大肠杆菌JM109购于TaKaRa公司；质粒pCAMBIA1301S，由华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室涂金星教授赠予；该质粒载体含有35S启动子元件、潮霉素抗性元件和GUS基因表达元件，可用于对阳性植株的筛选和鉴定；豫麦18、郑麦366，均为商品化小麦品种；实验试剂：溶液I，每升溶液中的组份为：1MTris-HCL（pH=8.0）、50mL，0.5MEDTA、20mL，其余为ddH2O，pH=7.5，高温灭菌；溶液II，0.4M的NaOH的ddH2O溶液与质量浓度2%的SDS的ddH2O溶液的等体积混合液；0.4M的NaOH的ddH2O溶液可由8gNaOH溶于500mL的ddH2O中配制而成，质量浓度2%的SDS的ddH2O溶液可由10gSDS溶于500mL的ddH2O中配制而成；需要强调的是，溶液II需现配现用；溶液III，每升溶液的制备方法为：在600mL的ddH2O中依次加入129.69g的KAc和100mL冰乙酸，溶解并混合均匀后，乙酸调节pH=4.8，然后用ddH2O定容至1L，pH=4.8；LB培养液：10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10gNaCl，双蒸水定容至1000mL（LB平板培养基另外加入15g琼脂），高压灭菌后4℃保存。实施例禾谷镰刀菌Tri101基因可以编码一种单端孢酶烯3-O-乙酰转移酶，这种酶可通过加乙酰基的形式来降解赤霉病毒素，从而降低小麦赤霉病的发病率。本实施例以重组有禾谷镰刀菌Tri101基因的植物表达载体（重组质粒pCAMBIA1301S-Tri101）的大量质粒提取和花粉管通道法转化小麦操作为例，对本申请所述小麦花粉管转基因育种方法进行了具体介绍。详细过程说明如下。（一）首先，将欲转化基因（目的基因Tri101基因）片段整合进入质粒基因组中，然后，采用热击法将含目标基因的表达质粒转入大肠杆菌感受态细胞，进行热激转化，转化后加入培养液进行抗性筛选，以获得重组菌株。具体过程为：（1）首先，设计引物对，并利用PCR技术扩增获得Tri101基因；根据Tri101基因序列设计如下引物对（引物由上海生工生物工程股份有本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种小麦花粉管转基因育种方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：（1）将含目标基因的表达质粒进行转化，获得重组菌株；（2）采用玻璃珠悬起菌落法提取质粒，具体过程为：首先，将步骤（1）中筛选所得重组菌株接种于含有抗性抗生素的平板培养基上，进行培养；其次，在平板上加入无菌水和灭菌的玻璃珠摇晃，利用玻璃珠悬起菌落，并将含有菌落的无菌水进行离心，保留沉淀细胞；最后，将沉淀细胞进行裂解，离心提取质粒；（3）利用花粉管通道法转化受体小麦，具体为：在小麦开花前，按照常规杂交育种的方法进行整穗、去雄、套袋；在去雄2 ~ 3天后，人工授粉；在小麦授粉1.5~2h后剪去部分柱头，然后在剪切后的柱头上滴加步骤（2）中所提取的质粒；滴加质粒后，套袋，做好标记，自然结实后收获小麦种子，对所收获的小麦的种子进一步培育、筛选获得相应的转基因植株。

【技术特征摘要】
1.一种小麦花粉管转基因育种方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：（1）将含目标基因的表达质粒进行转化，获得重组菌株；（2）采用玻璃珠悬起菌落法提取质粒，具体过程为：首先，将步骤（1）中筛选所得重组菌株接种于含有抗性抗生素的平板培养基上，进行培养；其次，在平板上加入无菌水和灭菌的玻璃珠摇晃，利用玻璃珠悬起菌落，并将含有菌落的无菌水进行离心，保留沉淀细胞；最后，将沉淀细胞进行裂解，离心提取质粒；（3）利用花粉管通道法转化受体小麦，具体为：在小麦开花前，按照常规杂交育种的方法进行整穗、去雄、套袋；在去雄2~3天后，人工授粉；在小麦授粉1.5~2h后剪去部分柱头，然后在剪切后的柱...

【专利技术属性】
技术研发人员：雷振生，常阳，周正富，秦毛毛，吴政卿，晁岳恩，王美芳，何盛莲，李文旭，杨攀，王亚欢，刘聪聪，张琨，柳东阳，汪庆昌，徐福新，刘加平，李巍，
申请(专利权)人：河南省农业科学院小麦研究所，
类型：发明
国别省市：河南,41