生长抑素基因工程亚单位苗的基因工程体制造技术

生长抑素基因工程亚单位苗的基因工程体，属生物高新技术领域产品。系采用人工合成单价或双价ＳＳ基因，分别插入ｐＥＴ３２表达系统和ｐＧＥＸ－６Ｐ－１表达系统适当位点，转化感受态大肠杆菌。从而获得Ｅ．ｃｏｌｉ－ＳＳ　１ａ／ＴＲＸ、Ｅ．ｃｏｌｉ－ＳＳ　２ｂ／ＴＲＸ和Ｅ．ｃｏｌｉ－ＳＳ　２ｃ／ＧＳＴ３株基因工程体。该基因工程体经发酵，提取纯化表达产物，即可配制成激生３号苗ａ、ｂ、ｃ３个型的油乳苗。本疫苗生产成本低廉，适于工业化生产。本基因工程体表达产物免疫原性良好，用于家畜和家禽，免疫增重效果显著，且其安全性高，无残留。图为：ＳＳ　１ａ／ｐＥＴ３２ｃ重组质粒的构建。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术为生长抑素基因工程亚单位苗的基因工程体，属生物高新
产品，专用于生产能促进家畜、家禽生长的生长抑素(SS)基因工程亚单位苗(新型激生系列苗)。生长抑素基因工程活载体苗及生长抑素(SS)基因工程亚单位苗(激生系列苗)促进动物生长的原理是通过激素的免疫调控促进动物生长。参与生长调节的激素有多种，其中由垂体分泌的生长激素(GH)和肝脏分泌的生长介素(SM)，亦称胰岛素样生长因子(IGFs)是调节核心，而GH和SM的合成和分泌又受下丘脑分泌的两种高位激素——生长激素释放激素(GRH)和生长抑素(SS)所调控。前者促进GH的合成和分泌，后者则抑制其合成和分泌。GH又作用于肝脏上的受体，促使SM的合成和分泌，SM则直接作用于多种组织，促进蛋白质的合成和细胞增殖，从而促使肌肉、内脏和骨骼的生长。SS系列苗免疫后，能诱导动物产生SS抗体，中和SS，解除生长抑制，使GH和SM等正向调节的激素水平提高，从而促进动物生长。见附图说明图1。自1981年以来，国外有不少报道关于应用人工合成的生长抑素(SS)，连接各种载体蛋白，如牛血清白蛋白、甲状腺球蛋白、卵清蛋白等，制备合成肽苗。用于免疫牛、羊、猪等均能促进GH释放增加，从而促进家畜生长，可提高日增重10％左右。也有应用SS合成肽苗免疫动物，制备SS抗血清，被动免疫家畜以促进生长的报道。但由于合成肽成本太高，上述研究均停留在理论研究水平，未能形成商品在畜牧生产中应用。现有技术中本课题组专利技术人之一——南京农业大学杜念兴教授，于七五期间主持农业部生物技术重点项目——生长抑素基因工程疫苗研究，先后构建了3个基因工程体。其中以痘苗病毒为载体，将SS基因与乙肝表面抗原(HBsAg)基因连接，构建成HBs/SS融合基因，将其插入痘苗病毒载体中，获得能表达HBsAg/SS融合蛋白的重组痘苗病毒(vv-HBs/SS)。用该基因工程体制成生长抑素基因工程活载体苗，简称激生1号苗。经实验室小试，增重效果显著，并已通过农业部鉴定，被认为是国内外第一个有望用于促进家畜生长的基因工程苗，处于国际领先水平，建议进行中试，尽快将本成果推广应用，转化为生产力，1997年经国家科委(科技部)列入863中试项目。经农业部生物基因工程安全管理委员会审批为安全等级I级，同意进行中间试制。经中间试制和田间试验结果表明，该疫苗生产工艺简单，不造成环境污染，免疫猪、牛、羊等家畜安全有效。该技术2000年通过科技部验收，经农业部生物基因工程安全管理委员会批准商品化生产。同年获得大北农科技成果奖和香港中华专利博览会金奖，专利技术专利申请号00107295.1。鉴于激生1号疫苗只能用于家畜，不能用于家禽，免疫期只有3个月，再次免疫时因产生抗痘苗病毒抗体，效果不理想。为弥补以上缺点，又设计研制了生长抑素基因工程亚单位苗(激生2号)，专利技术专利申请号00105675.1。基因工程亚单位苗和基因工程生产多肽类药物，表达产物的提取费用往往占生产成本的70％，第一个SS亚单位苗(激生2号苗)采用pET32c质粒中的硫氧还蛋白(TRX)为载体。构建时，将主基因SS插入载体蛋白TRX的长臂中间，在SS之后，还留有一个长长的尾巴。这样就使得作为主要免疫原的SS不能充分暴露，影响免疫原性的充分发挥，并且其表达产物主要以包涵体形式存在，不利于提取纯化。见图2。本专利技术的目的是针对现有技术中激生2号苗的基因工程体的缺陷，构建新型SS基因工程亚单位苗(激生3号苗)的基因工程体。该基因工程体表达产物呈水溶性，易于提取，而作为免疫原的SS又充分暴露，达到充分发挥SS基因的免疫原性目的。设置不同类型达到互测SS抗体的目的。本专利技术所提供的生长抑素基因工程亚单位苗的基因工程体(商品名为“激生3号”)，采用人工合成SS基因，将其插入载体蛋白表达系统，转化感受态大肠杆菌，提取重组质粒并经酶切鉴定、序列测定验证而成。生长抑素基因SS的氨基酸序列如下 其特征在于，SS基因设计中含终止子。其设计通式为5’-保护性碱基—内切酶—框架保证碱基—单价SS基因或双价SS基因—终止子—内切酶—保护性碱基—3’其中人工合成SS基因为单价SS基因或双价SS基因，在其3’端设有终止子。选用硫氧还蛋白(TRX)pET32表达系统时，SS基因插入位点以后的密码子不能表达，其长长的尾巴被截去，作为免疫原的SS得以充分暴露。见图3、4。选用载体蛋白为谷胱甘肽转移酶(GST)pGEX-6P-1系统时，因其本身没有尾巴，SS亦能充分暴露。共构建包括用单价SS基因与截去尾巴的硫氧还蛋白(TRX)pET32表达系统重组获得的基因工程体E.coli-SS 1a/TRX、用双价SS基因与截去尾巴的硫氧还蛋白(TRX)pET32表达系统重组获得的基因工程体E.coli-SS 2b/TRX和用双价SS基因与本身没有尾巴的pGEX-6P-1表达系统重组获得的基因工程体E.coli-SS 2c/GST 3株基因工程体。用单价SS基因与截去尾巴的硫氧还蛋白(TRX)pET32表达系统获得的基因工程体，分类大肠埃希氏杆菌，命名E.coli-SS 1a/TRX，保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏地址中国.北京.中关村.2714信箱 邮政编码100080保藏号0705用双价SS基因与截去尾巴的硫氧还蛋白(TRX)pET32表达系统获得的基因工程体，分类大肠埃希氏杆菌，命名E.coli-SS 2b/TRX，保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏地址中国.北京.中关村.2714信箱 邮政编码100080保藏号0707用双价SS基因与本身没有尾巴的pGEX-6P-1表达系统获得的基因工程体，分类大肠埃希氏杆菌，命名E.coli-SS 2c/GST，保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏地址中国.北京.中关村.2714信箱 邮政编码100080保藏号0708本专利技术所提供的生长抑素基因工程亚单位苗的基因工程体，与现有技术相比，具有以下优点和积极效果1)本专利技术所提供的新型SS基因工程亚单位苗(激生3号苗)的基因工程体，构建过程中采取切去TRX的部分长尾的办法，不仅不影响表达水平，而且表达水平高、表达量在20％以上，表达产物是水溶性，易于提取，提取纯度在85％以上；而作为免疫原的SS又充分暴露，可以充分发挥SS基因的免疫原性。克服了激生2号苗的基因工程体主要以包涵体形式存在、表达产物难以提取的困难，并且其主基因SS之后留有一个长长的尾巴，影响免疫原性充分发挥的缺陷。2)用本专利技术新构建的基因工程体E.coli-SS 1a/TRX、E.coli-SS 2b/TRX和E.coli-SS2c/GST(3株)分别用于生产3种生长抑素基因工程亚单位苗，——激生3号a型、b型和c型。其基因工程体表达产物为水溶性，提取和纯化方便，生产工艺简单，成本低廉，适合于大规模工业化生产。用于免疫动物，增重20％以上，效果显著，安全性高，无激素和药物残留，可用以替代促进动物生长的化学添加剂，无任何潜在危险。3)用本专利技术新构建的基因工程体(3株)分别用于生产3种生长抑素基因工程亚单位苗，——激生3号a型、b型和c型。它们都是以SS为主基因，其基本设计相似而又功能互补。激生3号苗a本文档来自技高网...

【技术保护点】
生长抑素基因工程亚单位苗的基因工程体，系采用人工合成ＳＳ基因，分别插入不同载体蛋白表达系统，转化感受态大肠杆菌而成，重组质粒经酶切鉴定，序列测定，证实完全符合设计要求，生长抑素基因ＳＳ的氨基酸序列如下： Ａｌａ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｔｒｐ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｔｈｅ Ｓｅｒ Ｃｙｓ ＊＊＊ 其特征在于，基因设计中含终止子，使ＳＳ多肽充分暴露，其设计通式为： ５’－保护性碱基－内切酶－框架保证碱基－单价ＳＳ基因或双价ＳＳ基因－终止子－内切酶－保护性碱基－３’ 其中人工合成ＳＳ基因为单价ＳＳ基因或双价ＳＳ基因，选用表达系统为可使ＳＳ多肽暴露的载体蛋白表达系统。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：杜念兴，李光富，
申请(专利权)人：南京南农高科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：84[中国|南京]