一种重组复制缺陷型腺病毒载体狂犬病毒基因工程疫苗制造技术

本发明专利技术提供了一种重组复制缺陷型腺病毒载体狂犬病毒基因工程疫苗，它是以Ｅ１、Ｅ３联合缺失的复制缺陷型人腺病毒为载体，在Ｅ１区携带有狂犬病毒包膜糖蛋白编码基因及调控其进行高效表达的元件，所述的狂犬病毒包膜糖蛋白编码基因来自强神经毒力ＣＶＳ－Ｎ２ｃ狂犬病毒株，具有ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１所示的序列或者编码相同蛋白质的与其具有遗传密码简并性的序列，或者它们的片段。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种用于预防动物狂犬病的重组疫苗。
技术介绍
狂犬病是由狂犬病毒感染引起的致死性人畜共患传染病，以侵犯中枢神经系统为特征。狂犬病广泛发生于世界各地，我国是狂犬病的高发区。用狂犬病毒疫苗进行预防注射是预防和控制狂犬病发生的有效途径。狂犬病毒疫苗由早期的神经组织疫苗逐步发展，目前广泛采用原代细胞培养疫苗和传代细胞精制纯化疫苗，这些疫苗具有较好的免疫效果，但受生产成本昂贵，运输和贮存必须依赖于低温″冷链″，给药方式等因素限制，不便应用于狂犬病毒的储存宿主即犬、狐狸等各种野生或家养动物的免疫接种。有效免疫接种狂犬病毒的传染源，切断其传播途径有赖于发展新一代的基因工程重组疫苗。联合缺失腺病毒早期区基因E1和E3的重组复制缺陷型腺病毒具有宿主范围广，对外界环境有一定的抵抗能力，可口服诱导免疫等优点，具有作为基因工程狂犬病毒疫苗的优良载体的潜力。而且，这种E1和E3联合缺失的重组复制缺陷型腺病毒还具有一个突出优点由于E1和E3区编码多种与对抗机体免疫防卫有关的蛋白质，联合缺失这两个区域的重组病毒疫苗可望更有效地刺激免疫应答，并成功地克服在新生动物中可能存在的来自于母体的免疫干扰。研究和开发基于复制缺陷型腺病毒的重组狂犬病毒疫苗将有望有效预防，控制甚至根除我国狂犬病的发生。 狂犬病毒共有5种结构蛋白，其中包膜糖蛋白(Glycoprotein，GP)由于能有效激发机体产生保护性免疫反应而被作为保护性抗原运用于亚单位狂犬病毒基因工程疫苗的研究中。由于单负链RNA病毒的RNA聚合酶缺乏校对功能，加之体内免疫选择压力，GP蛋白具有较高的突变率，而不少研究提示狂犬病毒疫苗毒株的选择与其免疫保护效果有关。国际上常用ERA株(Evelyn Rockitniki Abelseth strain)来源的糖蛋白基因作为亚单位狂犬病毒基因工程疫苗的保护性抗原，ERA株是早期分离的兽用疫苗株。而我国尚未有成熟的亚单位狂犬病毒基因工程疫苗，而采用aG株组织培养疫苗，这一毒株经过多年传代培养与目前的狂犬病毒野毒株(街毒)基因差异较大。CVS-N2c狂犬病毒是狂犬病毒CVS24株在小鼠脑内或成神经细胞瘤细胞中传代培养中的优势变种(variant)，具有强神经毒力。但CVS-N2c狂犬病毒GP蛋白在神经元细胞中仅为低水平表达，其引起病理变化及作为亚单位疫苗用以预防和控制狂犬病的效力尚不明确。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种用于预防动物狂犬病的重组疫苗，这种疫苗是以强神经毒力的狂犬病毒株CVS-N2c糖蛋白GP作为保护性抗原的E1，E3联合缺失的复制缺陷型重组腺病毒rAdCVSGP。 本专利技术提供了一种用于预防动物狂犬病的重组疫苗，它是以E1、E3联合缺失的复制缺陷型人腺病毒为载体，在E1区携带有狂犬病毒包膜糖蛋白编码基因及调控其进行表达的元件，所述的狂犬病毒包膜糖蛋白编码基因具有SEQ ID NO1所示的序列或者编码相同蛋白质的与其具有遗传密码简并性的序列，或者它们的片段。 本专利技术的疫苗以人腺病毒为载体。人腺病毒有多个血清型，本专利技术载体可以是采用5型人腺病毒(ATCC VR-5)。将其缺失部分早期基因表达E1编码区(Δ481～3533bp)和E3编码区(Δ28130～30820bp)，外源GP基因可通过大肠杆菌内同源重组过程整合入E1区(He TC，Zhou S，daCosta LT，et al.Proc Natl Acad Sci USA.1998，95(5)2509-2514)。在本专利技术的疫苗中，所述的狂犬病毒包膜糖蛋白，来源于强神经毒力CVS-N2c株GP基因全长cDNA，也可为编码相同蛋白质的与其具有遗传密码简并性的序列，或其部分编码序列如膜外区(58-1375bp)或膜外区部分抗原决定簇序列。在本专利技术的疫苗中，所述的狂犬病毒包膜糖蛋白编码基因可以用任何已知的可引导外源基因在真核细胞中表达的调控元件进行调控，例如，该GP基因序列前人工可以加入Kozak高效翻译调控核心序列ACC(ATGG)，GP基因可以处于外源CMV启动子及SV40加尾信号转录元件的控制之下。rAdCVSGP在动物细胞中并不复制，但能表达外源基因GP，其基因组在连续传代过程中保持稳定。 本专利技术构建的表达CVS-N2c包膜糖蛋白的复制缺陷型重组腺病毒rAdCVSGP的293细胞病毒培养物已根据布达佩斯条约，于2001年7月5日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)进行了保藏。保藏中心地址为中国北京中关村北一条11号，保藏号为CGMCC0597。 本专利技术所采用的狂犬病毒保护性抗原是从昆明鼠脑组织中克隆的强神经毒力CVS-N2c糖蛋白基因。为保证CVS-N2c GP基因在真核细胞内的高效表达，还在克隆位点后加入了Kozak保守序列ACC(ATGG)[Kozak M.Proc Natl Acad Sci USA.1990，878301-8305]。如上文所述，复制缺陷型重组腺病毒缺失部分早期基因表达E1编码区(Δ481～3533bp)和E3编码区(Δ28130～30820bp)，在动物细胞中并不复制，但能表达外源基因，狂犬病毒保护性包膜糖蛋白基因及表达调控元件被插入E1区。 本专利技术的重组病毒的基本特性a透射电镜观察到所得的重组腺病毒直径约为70nm，具有较为典型的腺病毒形态；b酶切图谱鉴定表明在连续传代培养过程中，重组腺病毒基因组稳定；c重组病毒在293细胞中滴度至少可达约107-109pfu/ml。dWestern blot实验表明表达的GP蛋白可被兔抗狂犬病毒血清所特异性识别，表达的GP蛋白分子量约为66Kd，与天然GP的分子量相仿。 以CVS-N2c GP基因为特异性保护抗原的重组复制缺陷型腺病毒rAdCVSGP有很好的免疫保护作用约1.0×108pfu rAdCVSGP腹腔免疫小鼠在35.8LD50或38.0LD50毒力的直接脑内致死性攻击实验中其免疫小鼠存活率分别为100％和87.5％，单次皮下免疫接种1.0×109pfurAdCVSGP可使100％受试小鼠在68.0LD50的脑内攻击下存活。与肌肉外周攻击等其它方法相比，这种高剂量的脑内攻毒实验条件更为严格，结果更有说服力。实验表明rAdCVSGP接种对小鼠脑内高剂量病毒的致死性攻击具有很好的免疫保护效果。 接种rAdCVSGP能诱导Beagle犬产生高滴度的中和抗体。Beagle犬皮下多点接种1.0×1011pfu重组rAdCVSGP病毒，以快速荧光灶抑制实验(Rapid Flourescent Focus Inhibition Test，RFFIT)检测中和抗体滴度。接种后一周即可诱导产生具有保护作用的狂犬病特异性中和抗体，抗体滴度在4周左右上升到最高峰，可达800IU/ml，之后缓慢下降，在检测期(21周)内远远高于保护性抗体水平(0.5IU/ml)。 附图的简要说明图1为本专利技术狂犬病毒CVS-N2c GP基因重组复制缺陷型腺病毒的构建示意图。 A狂犬病毒CVS-N2c GP基因被亚克隆于pAdShuttle-CMV，获得pAdShuttle-CMV/GP与骨架载体pAdEasy-1一起共转化大肠杆菌BJ5183。 B在大肠杆菌BJ51本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组复制缺陷型腺病毒载体狂犬病毒基因工程疫苗，它是以Ｅ１、Ｅ３联合缺失的复制缺陷型人腺病毒为载体，在Ｅ１区携带有狂犬病毒包膜糖蛋白编码基因及调控其进行表达的元件，其中，所述的狂犬病毒包膜糖蛋白编码基因具有ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１所示的序列或者编码相同蛋白质的与其具有遗传密码简并性的序列，或者它们的片段。

【技术特征摘要】
1.一种重组复制缺陷型腺病毒载体狂犬病毒基因工程疫苗，它是以E1、E3联合缺失的复制缺陷型5型人腺病毒为载体，在E1区携带有狂犬病毒包膜糖蛋白编码基因及调控其进行表达的元件，其中，所述的狂犬病毒包膜糖蛋白编码基因具有SEQ ID NO1所示的序列或者编码相同蛋白质的与其具有遗传密码简并性的序列。2.按照权利要求1所述的疫苗，其中，所述的狂犬病毒包膜糖蛋白编码...

【专利技术属性】
技术研发人员：王树惠，李文辉，
申请(专利权)人：中国医学科学院基础医学研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]