一种预测小麦苗期纹枯病抗性的方法技术

本发明专利技术提供一种预测小麦苗期纹枯病抗性的方法，具体步骤如下：（A）将待测小麦品种或品系的麦粒浸种萌发、接种后培养12d；（B）取待测小麦幼苗基部包括叶鞘的1cm茎秆，称重，记为A，单位为mg；提取茎秆总DNA，作为待测DNA样品，体积记为B，单位为μL；(C)以步骤B获得的待测DNA样品为模板，以SEQ.ID NO:1为正向引物，SEQ.ID NO:2为反向引物，进行荧光定量PCR检测，获得CP值；重复再检测两次，获得三次检测的CP平均值C；(D)根据公式E=[B×10(31.784-C)/3.562]/A计算待检测小麦幼苗基部茎秆禾谷丝核菌的DNA含量E；(E)以上述相同的A-D步骤获得对照样品淮麦18幼苗的基部茎秆禾谷丝核菌的DNA含量E1；(F)通过E和E1的比值来预测小麦幼苗期的纹枯病抗性。

【技术实现步骤摘要】
一种预测小麦苗期纹枯病抗性的方法
本专利技术涉及小麦植物保护和育种领域，特别是一种预测小麦苗期纹枯病抗性的方法。
技术介绍
小麦纹枯病(Wheatsharpeyespot)主要由禾谷丝核菌(RhizoctoniacerealisVanderhoeven)引起，是危害性较大的世界性土传真菌小麦病害(HamadaMS,YinYN,ChenHG,MaZ.TheescalatingthreatofRhizoctoniacerealis,thecausalagentofsharpeyespotinwheat.《PestManaggmentScience》,2011,67:P.1411-1419)，现已成为我国长江流域的主要病害,并逐渐蔓延到黄淮麦区，每年造成小麦产量损失严重。培育和使用纹枯病抗性品种无疑是控制该病害最有效和最经济的途径，其中最为关键的是小纹枯病抗性鉴定方法的建立，目前，报道的小麦纹枯病抗性鉴定方法多样，鉴定标准不一，主要分为自然病圃鉴定和人工接种鉴定，人工接种鉴定根据接种方法的不同，又有玉米砂混法、菌丝外贴法、嵌入法、土表接种法和沟带接种法。这些鉴定方法由于受环境影响较大，并且采用的接种菌株不同，病害调查和采样方法也不一致，因而病害鉴定结果存在差异，一定程度影响了对小麦材料抗性评价的准确性。另外，小麦根部和茎基部其他病害，如小麦根腐病、小麦全蚀病以及小麦茎腐病等，由于与纹枯病早期病症相似，也对小麦纹枯病抗性的准确评价造成干扰。因此，建立准确、稳定和可靠的小麦苗期纹枯病抗性鉴定方法非常必要。小麦的一生中，纹枯病发生呈“S”型曲线，两个发病高峰分别在苗期和拔节孕穗期(《中国小麦纹枯病的研究现状与展望》，张会云等，麦类作物学报，2007)，苗期主要造成烂芽和病苗死苗，拔节孕穗期主要造成花秆烂茎，直至枯白穗(《小麦纹枯病的研究进展(综述)》，檀根甲等，安徽农业大学学报，1998)，研究发现，小麦产量损失与纹枯病病情严重度呈显著线性相关，严重度每提高一级，产量损失增加约10-20％左右。始病愈早，发病愈重，相应的产量损失愈大。孕穗期以前发病，产量损失25-40％，始穗后发病，产量损失一般小于20％(《中国小麦纹枯病的研究现状与展望》，张会云等，麦类作物学报，2007)，然而目前的抗性鉴定方法多针对拔节孕穗期的小麦，对苗期的抗性和鉴定方法重视不够。目前，只有专利号为：201110234958.3，专利技术名称为“小麦幼苗的纹枯病抗性鉴定方法”的中国专利公开了一种小麦幼苗的纹枯病抗性鉴定方法，但该鉴定方法使用目测病症的鉴定方法，需要鉴定者具有一定的纹枯病鉴定经验，难以消除小麦根部和茎基部其他病害的病症干扰，预测结果难以排除人为影响，难以做到统一、客观；专利号为：200810196380.5，专利技术名称“小麦纹枯病抗性苗期鉴定的方法”的中国专利，虽然名称是苗期鉴定，实际鉴定的是拔节孕穗期的纹枯病抗性，因此，如何通过建立规范的仪器定量测定方法预测小麦苗期的纹枯病抗性一直是本领域亟待解决的技术难题。实时荧光定量PCR(QuantitativeReal-timePCR)是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次PCR循环后产物总量的方法,其通过在PCR体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行总量分析或通过CP值对模板进行相对定量分析，与普通PCR相比，其特异性更强，灵敏度更高，目前，该技术已经成功运用于土壤中纹枯病菌DNA的定量检测(GuoY,LiW,SunH,WangN,YuH,ChenH.DetectionandquantificationofRhizoctoniacerealisinsoilusingreal-timePCR.《JGenPlantPathol》,2012,78:P.247-254)。然而，小麦茎秆中纹枯病菌的DNA含量与小麦自身的纹枯病抗性的关系尚未有文献报道，也未见将荧光定量PCR应用于预测小麦苗期纹枯病抗性的相关报道。
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术提供一种通过对苗期小麦基部茎秆禾谷丝核菌DNA含量的PCR定量测定，预测小麦幼苗纹枯病抗性的方法，本专利技术是这样实现的：一种预测小麦苗期纹枯病抗性的方法，其特征在于，取待测小麦幼苗基部包括叶鞘的茎秆1cm,称重并提取DNA,进行荧光定量PCR检测，再通过公式计算小麦基部茎秆禾谷丝核菌的DNA含量，以淮麦18作为对照，预测小麦苗期纹枯病抗性，具体步骤如下：A)将待测小麦品种或品系的麦粒于20℃浸种、使麦粒萌发4-6mm的幼芽，将萌发幼芽的麦粒置于20℃的禾谷丝核菌菌丝悬浮液中浸泡5min接种；接种后继续培养12d；B)取待测小麦幼苗基部包括叶鞘的1cm茎秆，称重，记为A，单位为mg；以CTAB法提取茎秆总DNA，将浓度调整为25ng/μL,作为待测DNA样品，体积记为B，单位为μL；C)以步骤B获得的待测DNA样品为模板，以SEQ.IDNO:1为正向引物，SEQ.IDNO:2为反向引物，进行荧光定量PCR检测，获得CP值；重复再检测两次，获得三次检测的CP平均值C；D)根据公式E＝[B×10(31.784-C)/3.562]/A计算待检测小麦幼苗基部茎秆禾谷丝核菌的DNA含量E；E)以上述相同的A-D步骤获得对照样品淮麦18幼苗的基部茎秆禾谷丝核菌的DNA含量E1；F)通过E和E1的比值来预测小麦幼苗期的纹枯病抗性，若E＞E1×130％，则待测小麦品种或品系为感病；若E＜E1×30％，则待测小麦品种或品系为抗病；若E1×30％≤E≤E1×130％，则待测小麦品种或品系为中抗。进一步，本专利技术中，步骤C荧光定量PCR检测反应体系为：2×SYBR@PremixExTaqTM5μL，5μM正向引物和反向引物各1μL，模板DNA3μL；反应步骤为：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火10s，72℃延伸20s，共40个循环。本专利技术的优点在于：对小麦幼苗的纹枯病抗性鉴定不受生长季节的限制，随时可以进行；鉴定在室内控温控湿的条件下进行，减少了环境条件对纹枯病抗性鉴定结果的影响；相对于现有人工目测的鉴定方式，本专利技术采用鉴定采用仪器定量测定，减少了人为目测误差的影响，同时鉴定不受根部以及茎基部其他病害的干扰，结果更准确。附图说明图1为本专利技术实施例标准曲线示意图。具体实施方式实施例涉及的核苷酸序列：SEQIDNO:15’-CCTAAATGAGTCTGGAGTAAGTC-3’；SEQIDNO:25’-GCTAGTGCGGTCAATGTATAG-3’；实施例中所涉及材料：宁麦13由江苏省农业科学院提供；淮麦18由江苏省徐淮地区淮阴农业科学研究所提供，其审定编号为国审麦2001005；纹枯病菌采用致病力强的禾谷丝核菌R0301由江苏省农业科学院植物保护研究所麦类病害室提供，该菌株已在《不同施肥处理对小麦纹枯病发生及根际微生物的影响》(熊桂林等,江苏农业学报,2008,24(4):414-418)中公开；SYBR@GreenI试剂由宝生物工程(大连)有限公司生产；荧光定量PCR仪由Roche生产。实施例中禾谷丝核菌R0301悬浮液制备方法、小麦的培养方法以及PDA培养基的制备方法，均参照ZL20111023495本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种预测小麦苗期纹枯病抗性的方法，其特征在于，取待测小麦幼苗基部包括叶鞘的茎秆1cm,称重并提取DNA,进行荧光定量PCR检测，再通过公式计算小麦基部茎秆禾谷丝核菌的DNA含量，以淮麦18作为对照，预测小麦苗期纹枯病抗性，具体步骤如下：A）将待测小麦品种或品系的麦粒于20℃浸种、使麦粒萌发4‑6mm 的幼芽，将萌发幼芽的麦粒置于20℃的禾谷丝核菌菌丝悬浮液中浸泡5 min接种；接种后继续培养12d；B）取待测小麦幼苗基部包括叶鞘的1cm茎秆，称重，记为A，单位为mg；以CTAB法提取茎秆总DNA，将浓度调整为25ng/μL,作为待测DNA样品，体积记为B，单位为μL；C）以步骤B获得的待测DNA样品为模板，以SEQ.ID NO:1为正向引物，SEQ.ID NO:2为反向引物，进行荧光定量PCR检测，获得CP值；重复再检测两次，获得三次检测的CP平均值C；D）根据公式E=[B×10(31.784‑C)/3.562]/A计算待检测小麦幼苗基部茎秆禾谷丝核菌的DNA含量E；E)以上述相同的A‑D步骤获得对照样品淮麦18幼苗的基部茎秆禾谷丝核菌的DNA含量E1；F)通过E和E1的比值来预测小麦幼苗期的纹枯病抗性，若E＞E1×130%，则待测小麦品种或品系为感病；若E＜E1×30%，则待测小麦品种或品系为抗病；若E1×30%≤E≤E1×130%，则待测小麦品种或品系为中抗。...

【技术特征摘要】
1.一种预测小麦苗期纹枯病抗性的方法，其特征在于，取待测小麦幼苗基部包括叶鞘的茎秆1cm,称重并提取DNA,进行荧光定量PCR检测，再通过公式计算小麦基部茎秆禾谷丝核菌的DNA含量，以淮麦18作为对照，预测小麦苗期纹枯病抗性，具体步骤如下：A）将待测小麦品种或品系的麦粒于20℃浸种、使麦粒萌发4-6mm的幼芽，将萌发幼芽的麦粒置于20℃的禾谷丝核菌菌丝悬浮液中浸泡5min接种；接种后继续培养12d；B）取待测小麦幼苗基部包括叶鞘的1cm茎秆，称重，记为A，单位为mg；以CTAB法提取茎秆总DNA，将浓度调整为25ng/μL,作为待测DNA样品，体积记为B，单位为μL；C）以步骤B获得的待测DNA样品为模板，以SEQ.IDNO:1为正向引物，SEQ.IDNO:2为反向引物，进行荧光定量PCR检测，获得CP值；重复再检测两次，获得三次...

【专利技术属性】
技术研发人员：周淼平，姚金保，马鸿翔，余桂红，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：江苏;32