阿司匹林抵抗相关的P2Y1基因多态性位点及应用制造技术

本发明专利技术公开了阿司匹林抵抗相关的P2Y1基因多态性位点及应用。抗血小板药物（尤其是阿司匹林）在缺血性卒中的防治中起着至关重要的作用，但是目前的调查结果表明很多缺血性卒中患者即使服用了抗血小板药物，仍然反复再发卒中，这种现象称为抗血小板药物抵抗。申请人明确了一个与阿司匹林抵抗相关的P2Y1基因多态性位点：P2Y1（A745G），并针对该位点设计了检测该位点多态性的引物，该引物可用于制备筛选阿司匹林抵抗患者试剂盒，以为缺血性卒中患者选择抗血小板药物，降低阿司匹林抵抗及卒中复发率。

【技术实现步骤摘要】
阿司匹林抵抗相关的P2Y1基因多态性位点及应用
本专利技术涉及医学疾病治疗药物选择领域，具体涉及阿司匹林抵抗相关的P2Y1基因多态性位点及应用。技术背景随着我国人口老龄化，脑血管病发病率逐年攀升，最新调查结果表明从2010年起脑血管病已成为超越肿瘤危害中国人健康的第一大杀手，每年我国新发病例200万，缺血性脑血管病占70～80％，复发患者占27％，70％的患者留有神经功能缺损，脑血管病的高致死率、致残率和复发率已造成了极大的社会负担和经济负担。抗血小板药物(尤其是阿司匹林)在脑血管病的防治中起着至关重要的作用，但是目前的调查结果表明很多脑血管病患者即使服用了抗血小板药物，仍然反复再发卒中，这种现象称为抗血小板药物抵抗。抗血小板药物抵抗与诸多因素相关，如脑血管病相关危险因素(性别、糖尿病、吸烟、代谢综合征、急性冠脉综合征、既往心血管事件、肝肾功能异常、血液系统疾病等)，患者依从性或药物剂量，药物相互作用及基因多态性等。其中基因多态性是目前研究热点。既往研究发现，在体内影响阿司匹林作用的多个环节的因子存在基因多态性，这种多态性直接影响其功能，从而使得不同个体服用阿司匹林后对血小板的反应不同。据不完全统计，临床阿司匹林抵抗的患者高达40％，但是因为影响阿司匹林作用的靶点众多，到目前为止，阿司匹林抵抗相关的基因多态性还不确定。但是阿司匹林作为缺血性脑血管疾病二级预防的重要药物，尽快明确阿司匹林抵抗相关基因多态性至关重要。P2Y1是血小板表面G蛋白偶联受体，ADP通过P2Y1和P2Y12受体刺激血小板的激活和聚集。基于申请人最近的研究，申请人明确了一个与阿司匹林抵抗相关的P2Y1基因多态性位点：P2Y1(A745G)，该位点可用于为缺血性卒中患者选择抗血小板药物，降低阿司匹林抵抗及卒中复发率。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供了阿司匹林抵抗相关的P2Y1基因多态性位点：A745G。该位点位于人P2Y1基因全长的第745位，其碱基为A或G，携带有P2Y1突变体745G等位基因的患者与野生型A745患者相比，更易出现阿司匹林抵抗。本专利技术的另一个目的在于提供了检测阿司匹林抵抗相关P2Y1基因多态性位点A745G的引物。本专利技术最后一个目的在于提供了基于P2Y1基因多态性位点A745G的引物在制备筛选阿司匹林抵抗患者试剂盒中的应用。该试剂盒可用于筛选阿司匹林抵抗患者，以便更好的为缺血性卒中患者选择抗血小板药物，降低阿司匹林抵抗及卒中复发率。为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术措施：与阿司匹林抵抗相关的P2Y1基因多态性位点，该位点是在人P2Y1基因的745位发生了A→G的突变，经检测携带有P2Y1突变体745G的患者更容易发生阿司匹林抵抗。基于P2Y1基因的A745G位点设计引物，然后对该位点进行检测。本专利技术的保护内容还包括检测阿司匹林抵抗相关P2Y1基因多态性位点A745G的引物，该引物只要是基于P2Y1基因的A745G位点设计的引物，并能成功扩增出包括P2Y1基因的A745G的DNA片段的，均为本专利技术的保护内容。优选的，根据上述P2Y1基因多态性位点A745G设计的引物为：正义链：5‘-CACGGGTGGCCATGTCGC-3’反义链：5‘-TACCAGGTAAATCGATTT-3’；或正义链：5‘-CACATGGGGGAGTTCAGG-3’反义链：5‘-AACAGTCAGTACAATGAT-3’；或正义链：5‘-ACAAAGACTGTACGTAGT-3’；反义链：5‘-GTCACCTGATACGTGGCA-3’。基于P2Y1基因多态性位点A745G的引物在制备筛选阿司匹林抵抗患者试剂盒中的应用，包括利用P2Y1(A745G)位点引物对缺血性卒中患者的DNA进行检测，若检测到携带有P2Y1突变体745G的患者，则该患者有更易产生阿司匹林抵抗的趋势，检测方法包括但不限于目前已有的针对SNP位点的检测技术。包括利用本专利技术提供的P2Y1(A745G)位点引物，与其他阿司匹林抵抗相关的多态性位点引物结合组成的试剂盒，对患者的DNA进行检测，来筛选更易产生阿司匹林抵抗的患者。所述的其他与阿司匹林抵抗相关的多态性位点为：人COX-1基因多态性位点(A842G)，引物为：正义链：5‘-AAGCCTTATTAGAGGGTA-3’，反义链：5‘-TACTTTGACGCCGGTGGG-3’；和人GPⅠa基因多态性位点(C807T)，引物：正义链：5‘-TTCCTTAACTGTTACTTC-3’，反义链：5‘-CTGTGCCATCTCCTATTT-3’。所述的其他与阿司匹林抵抗相关的多态性位点或为：人GPⅠa基因多态性位点(C807T)，引物：正义链：5‘-TTCCTTAACTGTTACTTC-3’，反义链：5‘-CTGTGCCATCTCCTATTT-3’和人GPⅢa基因多态性位点(A1166C)，引物：正义链：5‘-TGTCAGACACTACACTCA-3’，反义链：5‘-GGATAATCCTAGGAAAAT-3’。与现有技术相比，本专利技术具有以下特点：1)本专利技术提供的P2Y1基因多态性位点(A745G)与阿司匹林抵抗相关，意在为缺血性卒中患者更好的选择抗血小板药物，降低卒中复发率。2)本专利技术提供的针对检测P2Y1基因多态性位点A745G的引物，意在制备筛选阿司匹林抵抗的患者的试剂盒。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术作进一步说明。本专利技术所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案。实施例1：与阿司匹林抵抗相关的P2Y1基因多态性位点(A745G)的发掘：从卒中数据库中调取2010～2014年卒中患者数据，根据缺血性卒中诊断标准，筛选确诊为缺血性卒中患者，并且进一步选取明确服用阿司匹林作为二级预防(二级预防是针对已经有脑卒中症状或已发生卒中后的患者而言，这些人需要预防再次发生脑卒中)的患者为研究对象作为总样本(共5033人)。1.明确总样本中卒中复发的人数，探讨总样本中P2Y1(A745G)基因的多态性与卒中复发的关系(表2)；2.总样本中，回院复诊患者(包括已复发的和未复发的患者，共3429人)，采集患者外周血，采用VerifyNow仪器检测阿司匹林反应单元(ARU)，确定ARU≥550的人数，探讨P2Y1(A745G)基因的多态性与ARU≥550的关系(表1)。本专利技术实施例中中，以下两种情况任意一种发生均视为发生阿司匹林抵抗：1.若患者服用阿司匹林期间，仍然发生卒中，则定义为阿司匹林抵抗；2.采用VerifyNow仪器检测阿司匹林反应单元(ARU)，如果ARU≥550，则定义为血小板高反应性，表明这个患者存在阿司匹林抵抗。结果表明，服用阿司匹林进行二级预防的缺血性卒中患者中，与野生型患者相比，P2Y1(A745G)突变型组患者阿司匹林反应单元ARU值明显高，且ARU≥550患者人数明显高于野生型组(表1)；同时卒中复发率也明显高(表2)。本实施例中针对P2Y1(A745G)基因的多态性的检测通过以下方法实现：针对P2Y1基因多态性位点(A745G)设计引物如下：正义链：5‘-CACGGGTGGCCATGTCGC-3’反义链：5‘-TACCAGGTAAATCGATTT-3’。以患者总DNA为模板，利用常规PCR进行扩本文档来自技高网...

【技术保护点】
针对人P2Y1基因全长的第745位设计的引物。

【技术特征摘要】
1.针对人P2Y1基因全长的第745位设计的引物在制备筛选阿司匹林抵抗患者试剂盒中的应用；所述的引物，具体为：正义链：5‘-CACGGGTGGCCATGTCGC-3’和反义链：5‘-TACCAGGTAAATCGATTT-3’。2.一种用于筛选阿司匹林抵抗患者试剂盒，包括三对引物：正义链：5‘-CACGGGTGGCCATGTCGC-3’，反义链：5‘-TACCAGGTAAATCGATTT-3’；和正义链：5‘-AAGCCTTATTAGAGGGTA-3’，反义链：5‘-TACTTTGACGCCGGTGGG-3’；和正...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡波，毛玲，夏远鹏，贺权威，靳慧娟，李亚男，
申请(专利权)人：武汉欧瑞康安生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42