星斑川鲽微卫星分子标记位点及引物制造技术

本发明专利技术提供了星斑川鲽11个微卫星分子标记位点以及其多态性引物，所获引物的扩增结果具有高度的多态性和稳定性，为星斑川鲽的遗传多样性以及种群间的亲缘关系的鉴定提供资料，弥补现有技术的不足。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分子生物学DNA分子标记
，具体涉及星斑川鲽微卫星分子标 记的开发。
技术介绍
星斑川鲽（Platichthys stellatus)又称星突江鲽，隶属鲽形目鲽科川鲽属，为广 盐、冷水性种类，分布在中国、朝鲜、韩国、日本、俄罗斯及美国太平洋沿岸海域，在我国吉林 省的图们江也有分布。由于星斑川鲽营养价值高，口感独特，味道鲜美，所以市场价值高，在 国内外市场深受欢迎。目前，国内外有关星斑川鲽的研宄报道还比较少，主要集中在生物学 地位、生态分布以及种群资源量。另外，日本和法国学者利用同工酶分析了野生群体星斑川 鲽的种群遗传结构，还有一些学者对其生理、生化等方面进行了研宄，但目前对于星斑川鲽 微卫星方面的研宄则不多，在NCBI上公布的星斑川鲽的SSR序列只有158条，这在一定程 度上限制了星斑川鲽的遗传育种和品质改良。 微卫星标记（SSRs :simple sequence repeats)或短串联重复（Short tandem repeats，STRS)，是一种广泛应用的遗传学领域的DNA分子标记。SSRs是广泛存在真核生 物基因组中的简单重复DNA片段，一般每个重复单位仅1-6个碱基，重复数为10-20次，其 中动物体中以双核苷酸（CA/GT)n最为常见。微卫星具有多态性高，提供的遗传信息多，PCR 扩增效果重复性好，以及在基因组中分散分布等优点，常用于生物的遗传多样性分析，遗传 图谱和杂交育种等。由于微卫星研宄所用DNA的数量少，对样品要求低，因此，微卫星分析 在遗传学领域具有广泛的应用性。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供星斑川鲽11个微卫星分子标记位点以及其多态性引物，为 星斑川鲽的遗传多样性以及种群间的亲缘关系的鉴定提供资料，弥补现有技术的不足。 本专利技术利用高通量测序技术从星斑川鲽DNA基因组中筛选出11个微卫星位点，其 核苷酸序列分别是PTS :1-11，其序列为SEQ ID :1-11。 微卫星序列还包括在严格条件下与上述的核苷酸序列杂交的，包含相同微卫星重 复的核苷酸序列分子。 本专利技术微卫星引物是从序列SEQ ID :1-11的微卫星两端的侧翼序列上设计的正 向、反向引物。微卫星引物序列分别是SEQ ID :12-33 微卫星位点，位点序列和对应的引物信息如表1 : 表 1 toon] 本专利技术的微卫星多态性引物用于星斑川鲽遗传多样性检测，包括以下步骤： 1)基因组DNA的提取：采用天根海洋动物组织DNA提取试剂盒 2)微卫星PCR扩增：采用FAM、HEM、TAMRA荧光标记的微卫星引物扩增星斑川鲽基 因组DNA，获得其扩增产物。 3)扩增产物电泳：在毛细管电泳基因分析仪上电泳，用GS500LIZ作分子量内标， 个体扩增产物用peak Scanner Software(vl.O)对毛细管电泳数据初步处理。 4)遗传多样性分析：根据每个个体微卫星扩增产物的分子量的大小取定基因型， 利用PopGene 32计算遗传多样性参数。 本专利技术从星斑川鲽基因组DNA中筛选出11个微卫星位点，并根据这些位点在微 卫星位点两端的侧翼序列设计特异性引物，使用所获得引物的扩增结果具有多态性和稳定 性，可适用于星斑川鲽种群遗传多样性检测，个体鉴定以及分子辅助育种领域。【具体实施方式】 实施例一、微卫星分子标记的筛选 本专利技术根据构建的星斑川鲽脑组织的转录组文库中进行的SSR分析，对比转录组 文库中的Unigene筛选得到了 50个的微卫星分子标记的位点，并根据相关位点，设计了 50 对的筛选引物，在星斑川鲽的30个个体中进行验证。 实施例二、微卫星引物的验证 以星斑川鲽基因组为模板，用50对引物进行温度梯度PCR以摸索出最佳退火温 度，1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果。在已摸索出最佳退火温度的引物中挑选出12对 重新合成？八1、册]\^41狀标记的荧光标记引物。2(^1^体系？〇?:(1(1!120 13以1^册81^作『 4 μ L ;dNTPs (2. 5mM) 1. 6 μ L ;上游引物（IOmM) 0· 5 μ L ;下游引物（IOmM) 0· 5 μ L ;DNA 模板 0.28 μ L ;Thermo Scientific Phusion DNA polymerase (2U/μ L)0. 12 μ L。PCR 程序：98°C 30s，（98°C 10s，Tm 30s，72°C 20s)x30 cycle，72°C IOmin.用 ABI3730xl 全自动 DNA 狈U 序仪（上海派森诺生物科技有限公司）测序^Scanner Software(vl.O)对毛细 管电泳数据初步处理。软件PopGene 32进行遗传指标（等位基因（na:Observed number of alleles)、有效等位基因（ne:Effective number of alleles)、观测杂合度（Observed heterozygosity)、期望杂合度（Expected heterozygosity)、香农遗传指数（Shannon' s Information index(I))、Nei 氏多样性指数（Nei' s gene diversity index (Nei))、多 态信息含量（polymorphism information content (PIC)))计算。 实施例三、星斑川鲽微卫星引物在相近物种遗传多样性中的应用 1.首先，采用天根（TIANGEN)生物公司的海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒提 取星斑川鲽的基因组DNA。利用分光光度法和1 %的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的浓度和质 量。 2.用 FAM、HEM、TAMRA 荧光标记的引物 PCR 扩增，20uL 体系 PCR:ddH20 13uL; HF Buffer 4uL;dNTPs(2.5mM)1.6uL;上游引物（10mM)0.5uL;下游引物（10mM)0.5uL; DNA模板0.28 uL;Thermo Scientific Phusion DNA polymerase(2U/uL)0. 12 uLoPCR程 序：98°C 30s，（98°C 10s，Tm 30s，72°C 20s)x30 cycle，72°C IOmin.用毛细管电泳（上海 派森诺生物科技有限公司）检测。 3.用Peak Scanner Software (vl. 0)对毛细管电泳数据初步处理D软件PopGene 32进行遗传指标测定D (等位基因（na:0bserved number of alleles)、有效等位基因 (ne:Effective number of alleles)、观测杂合度（Observed heterozygosity)、期望杂 合度（Expected heterozygosity)、香农遗传指数（Shannon' s Information index (I)) λ Nei 氏多样性指数（Nei^ s gene diversity index (Nei))、多态信息含量（polymorphism information content (PIC)))计算。 表2 :11个微卫星位点的重复单位、引本文档来自技高网...

【技术保护点】
星斑川鲽微卫星位点，其特征在于具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.11中任一的碱基序列，它们分别标记编号为PT1、PT2、PT3、PT4、PT5、PT6、PT7、PT8、PT9、PT10、PT11。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王波，郑风荣，李青，
申请(专利权)人：国家海洋局第一海洋研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37