一种基于DNA分子标记的初烤烟叶品种纯度抽样检测方法技术

本发明专利技术涉及一种基于DNA分子标记的初烤烟叶品种纯度抽样检测方法，其包括以下步骤：步骤A：针对不同烤烟品种，进行亲本的SSR引物筛选，筛选出不同品种间有差异的SSR引物；步骤B：根据产烟区和待抽检烟叶的量，确定抽检批次；步骤C：从每批次的样品中随机抽取100片烟叶，重复取样3次，总共取样数量为300片。本发明专利技术利用DNA分子标记的检测方法进行初烤烟叶品种鉴定，并且通过BioMek NX

【技术实现步骤摘要】
一种基于DNA分子标记的初烤烟叶品种纯度抽样检测方法
本专利技术涉及一种抽样检测方法，尤其是涉及一种基于DNA分子标记的初烤烟叶品种纯度抽样检测方法。
技术介绍
烤烟品种特色优质品种红花大金元、K326、云系等深受卷烟工业企业的青睐，市场优势明显。由于受利益驱使、毗邻产区补贴政策、超产或减产等诸多因素的影响下，杂劣品种进入收购环节和烟叶跨产区流动时有发生，产区烟叶品种纯度波动真实存在。并且，随着宏观经济环境下行压力加大，控烟环境日趋严厉，工业企业烟叶原料库存高位运行和原料定额采购，烟叶市场需求拐点显现。已有部分工业企业提出对质量特点不明显、品种纯度不稳定、收购等级质量不高的产区下调需求计划。目前，还缺少科学有效的收购和工商交接环节烤后烟叶品种纯度抽样检测方法，品种的判定主要依据外观形态特征和判断者的经验。但烤后烟叶的外观形态受遗传、环境、烘烤等因素的多重影响，并非是截然可辨的特征，特别是非正常气候和生产条件下的烟叶外观形态较为混杂，变化规律复杂，容易引起误判，判定准确率较低。烤烟国标是目前分级、交售、收购、工商交接唯一可执行的强制标准。烤烟国标(GB2635-92)7.1.2和8.2.1中规定了抽样数量，但从成本和时效性上考虑对于DNA分子标记品种检测显然无法抽取如此大样品数量进行逐一检测。烤烟收购和工商交接工作中唯一可执行的标准为烤烟国标GB2635-92。烤烟国标中7.1.2和8.2.1中规定了抽样数量，但对于DNA分子标记检测这类成本较高的检测方法，样本抽样数量过大不具有现实可行性。由此可见，现有的烤烟的抽样检测方法存在着抽样量大，检测效果差，效率低，成本高的缺陷，亟待进一步改进。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供基于DNA分子标记的初烤烟叶品种纯度检测方法，以解决现有技术的问题。为实现上述目的，本专利技术提供一种基于DNA分子标记的初烤烟叶品种纯度抽样检测方法，其包括以下步骤：步骤A：针对不同烤烟品种，进行亲本的SSR引物筛选，筛选出不同品种间有差异的SSR引物；步骤B：根据产烟区和待抽检烟叶的量，确定抽检批次；步骤C：从每批次的样品中随机抽取100片初烤烟叶，重复取样3次，总共取样数量为300片，重复样品用于补缺检测或复检；步骤D：提取步骤C中的样品初烤烟叶的基因组DNA；步骤E：对所述样品初烤烟叶的基因组DNA进行质量评价；步骤F：利用被检测的样品初烤烟叶品种的SSR引物进行PCR检测；步骤G：对PCR扩增产物进行检测；步骤H：对检测的结果进行分析计算，确定品种纯度合格率。本专利技术的一个实施例中，所述步骤B中，抽检批次应覆盖所有产烟区，抽检的批次按照2万担/批次进行抽取，产量低于2万担的产烟区，不少于1批次。本专利技术的一个实施例中，所述步骤D中，所述基因组DNA提取的步骤如下：步骤D1：对抽取的样品初烤烟叶烘干，并研磨粉碎至烟叶粉末；步骤D2：取所述烟叶粉末70-100mg，并加入300-500μl裂解液，65℃水浴10-30min，加入100-200μl提取液，室温放置2-10min，12000r/min离心8-15min，取上清液加入96孔深孔板；步骤D3：利用BioMekNXp自动化工作站进行DNA提取；本专利技术的一个实施例中，所述步骤E中，通过紫外吸收法对所提取的DNA进行检测，当在260nm处有明显的吸收峰时，所述DNA质量合格。本专利技术的一个实施例中，所述步骤F中，SSR标记PCR扩增反应体系为：10×PCRbuffer，1.25μl；dNTP，0.2μl；TaqDNApolymerase，0.2μl；灭菌水，6.95μl；正向引物，0.2μl；反向引物，0.2μl；模板DNA，1μl。本专利技术的一个实施例中，所述步骤F中，PCR反应程序为：94℃预变性5min后，进入35个循环，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸7min，35个循环结束后72℃延伸10min，16℃保存。本专利技术的一个实施例中，所述步骤G中，所述PCR扩增产物通过聚丙烯酰胺电泳进行检测。本专利技术的一个实施例中，所述步骤H中，对检测的结果进行分析计算时，品种纯度合格率＝抽检合格批次/抽检总批次×100％。本专利技术的一个实施例中，所述烤烟品种为红花大金元、K326、云系。本专利技术的有益效果为：本专利技术利用DNA分子标记进行初烤烟叶品种纯度鉴定，通过BioMekNXp(Beckman)自动化工作站与磁珠法植物DNA提取试剂盒相结合的批量提取初烤烟叶的DNA，结合PCR和电泳体系，将整个检测周期缩短到半个工作日，大大提高了检测的效率。本专利技术对被抽检初烤烟叶抽样时，抽样量少，检测准确率高，检测成本低，检测时间短。具体实施方式本专利技术的一种基于DNA分子标记的初烤烟叶品种纯度抽样检测方法，只需要检测较少数量的样本就可以推断一批样本总体的品种纯度，本专利技术的DNA分子标记的初烤烟叶抽样检测方法包括以下步骤：步骤A：针对不同烤烟品种，进行亲本的SSR引物筛选，筛选出不同品种间有差异的SSR引物。其中，该烤烟品种为红花大金元、K326、云系。步骤B：根据产烟区和待抽检烟叶的量，确定抽检批次，抽检批次应覆盖所有产烟区，抽检的批次按照2万担/批次进行抽取，产量低于2万担的产烟区，不少于1批次。步骤C：从每批次的样品中抽取100片初烤烟叶，重复取样3次，总共取样数量为300片，重复样品用于补缺检测或复检。步骤D：提取样品初烤烟叶的基因组DNA，该初烤烟叶的基因组DNA提取的步骤如下：步骤D1：对抽取的初烤烟叶样品进行低温烘干，温度小于18℃，然后研磨烘干后的初烤烟叶粉碎至烟叶粉末。步骤D2：取所述烟叶粉末70-100mg，并加入300-500μl裂解液，65℃水浴10-30min，加入100-200μl提取液，室温放置2-10min，12000r/min离心8-15min，取上清液加入96孔深孔板；步骤D3：利用BioMekNXp自动化工作站进行DNA提取；步骤E：对所述初烤烟叶的基因组DNA进行质量评价，通过紫外吸收法对提取的DNA进行检测，当在260nm处有明显的吸收峰时，表明该DNA质量合格。步骤F：利用被检测的样品初烤烟叶品种的SSR引物，进行PCR检测；SSR标记PCR扩增反应体系为：10×PCRbuffer(with25mMMg2+)1.25μl；dNTP(2mM)0.2μl；TaqDNApolymerase(5U/μl)0.2μl；灭菌水6.95μl；正向引物(10μM/L)0.2μl；反向引物(10μM/L)，0.2μl；模板DNA(50ng/μl)1μl。PCR反应结束后，在10μlPCR产物中加入2μl上样缓冲液(0.25％溴酚蓝+0.25％二甲苯青+40％蔗糖水溶液)混匀备用(电泳)。步骤G：利用被检测的样品初烤烟叶品种的SSR引物，对PCR的扩增产物进行检测，PCR反应程序为：94℃预变性5min后，进入35个循环，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸7min，35个循环结束后72℃延伸10min，16℃保存。本专利技术的PCR产物采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，其采用Bio-RadPowerPAC3000和北京六一厂DYY-6C型电泳仪和北京六一仪器厂DYCZ-30/28B和DYCZ-28A型电泳槽进行。其中DYCZ-本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于DNA分子标记的初烤烟叶品种纯度抽样检测方法，其特征在于包括以下步骤：步骤A：针对不同烤烟品种，进行亲本的SSR引物筛选，筛选出不同品种间有差异的SSR引物；步骤B：根据产烟区和待抽检烟叶的量，确定抽检批次；步骤C：从每批次的样品中随机抽取100片初烤烟叶，重复取样3次，总共取样数量为300片，重复样品用于补缺检测或复检；步骤D：提取步骤C中的样品初烤烟叶的基因组DNA；步骤E：对所述样品初烤烟叶的基因组DNA进行质量评价；步骤F：利用被检测的样品初烤烟叶品种的SSR引物进行PCR检测；步骤G：对PCR扩增产物进行检测；步骤H：对检测的结果进行分析计算，确定品种纯度合格率。

【技术特征摘要】
1.一种基于DNA分子标记的初烤烟叶品种纯度抽样检测方法，其特征在于包括以下步骤：步骤A：针对不同烤烟品种，进行亲本的SSR引物筛选，筛选出不同品种间有差异的SSR引物；步骤B：根据产烟区和待抽检烟叶的量，确定抽检批次；步骤C：从每批次的样品中随机抽取100片初烤烟叶，重复取样3次，总共取样数量为300片，重复样品用于补缺检测或复检；步骤D：提取步骤C中的样品初烤烟叶的基因组DNA；步骤E：对所述样品初烤烟叶的基因组DNA进行质量评价；步骤F：利用被检测的样品初烤烟叶品种的SSR引物进行PCR检测；步骤G：对PCR扩增产物进行检测；步骤H：对检测的结果进行分析计算，确定品种纯度合格率。2.根据权利要求1所述的基于DNA分子标记的初烤烟叶品种纯度抽样检测方法，其特征在于，所述步骤B中，抽检批次应覆盖所有产烟区，抽检的批次按照2万担/批次进行抽取，产量低于2万担的产烟区，不少于1批次。3.根据权利要求1所述的基于DNA分子标记的初烤烟叶品种纯度抽样检测方法，其特征在于，所述步骤D中，所述基因组DNA提取的步骤如下：步骤D1：对抽取的样品初烤烟叶烘干，并研磨粉碎至烟叶粉末；步骤D2：取所述烟叶粉末70-100mg，并加入300-500μl裂解液，65℃水浴10-30min，加入100-200μl提取液，室温放置2-10min，12000r/min离心8-15min，取上清液加入96孔深孔板；步骤D3：利用BioMekNXp自动化工作站进...

【专利技术属性】
技术研发人员：张轲，陈丹，张冀武，杨青，孙浩巍，龙杰，张晓伟，王怡海，张家瑞，周继月，李锦辉，杨艺敏，陈茂建，张庆刚，
申请(专利权)人：云南省烟草质量监督检测站，
类型：发明
国别省市：云南,53