通过克隆性测序的高分辨率、高通量HLA基因分型制造技术

本发明专利技术提供了利用克隆性测序在单次测序运行中对多个个体进行完全的、多基因座的HLA基因分型的方法和试剂。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】通过克隆性测序的高分辨率、高通量HLA基因分型
技术介绍
I类和II类HLA基因座是人类基因组中最为多态性的基因，拼缀多态性的复杂模 式主要定位于II类基因的外显子2中以及I类基因的外显子2和3中。对于当前的HLA 分型方法，对于造血干细胞移植是临床上重要的HLA等位基因的等位基因水平分辨，在技 术上是挑战性的。几项大规模的研究展现了，通过降低急性和慢性移植物抗宿主疾病的发 生率和严重度以及改善成功的植入的比率，在供体和患者之间精确的、等位基因水平的HLA 匹配显著地改善了总体移植存活率。例如，当8个最显著的HLA基因座中的8个匹配时，与 8个中的6个对比，移植后的存活率在12个月后提高60%。当前的实践是维持骨髓供体登记，其中数百万潜在的供体在低-中分辨率下被 HLA分型为A、B、以及在许多情况下的DRBl基因座。根据这种初步的分型，选择多个潜在匹 配的不相关的供体，然后在这些和其他基因座的等位基因水平的分辨率下分型以鉴定与接 受者最佳匹配的供体。迄今为止，最高分辨率的HLA分型是使用利用毛细血管电泳的、荧光的、基于 Sanger的DNA测序获得的。然而，在HLA分型数据中的模糊性可能由于当两种等位基因被 一起扩增和测序时等位基因之间的多种多态性、以及产生的相位模糊性而被保留。分辨这 种模糊性需要费时间的方法，例如，单独地扩增然后分析两个等位基因。下一代的测序方法克隆性地并行增殖数百万的单独DNA分子，其然后也被并行 地测序。近来，通过这种下一代的焦磷酸测序(pyrosequencing)测序方法GM Life Sciences, Inc.)可获得的阅读长度提高到> 250个核苷酸。本专利技术提供了改进的HLA基 因分型方法，其基于这样的发现，克隆性测序可以用于设置外显子之内连锁的多态性的相， 使得每个HLA等位基因的序列的明确的测定成为可能。专利技术概述本专利技术部分地基于这样的发现，S卩，8-基因座HLA基因分型可以对获自多个受试 者的样品在单次测序运行中进行。在某些实施方式中，因而本专利技术提供了并行地测定超过 一个个体的 HLA 基因 HLA-A、HLA-B、HLA-C、DRB1、DQA1、DQB1、DPAl 和 DPBl 的 HLA 基因型的 方法，所述方法包括(a)对于每个个体，扩增包含多态性位点的HLA-A、HLA-B、HLA-C、DRB1、DQA1、 DQBU DPAl和DPBl基因的外显子，来获得每个个体的HLA-A、HLA-B, HLA-C, DRBU DQAU DQBUDPA1和DPBl扩增子，其中每个扩增反应用正向引物和反向引物进行来扩增HLA基因 外显子，其中(i)所述正向引物从5'到3'包含以下序列衔接头序列、分子识别序列和HLA 序列；和(ii)所述反向引物从5'到3'包含以下序列衔接头序列、分子识别序列和HLA 序列；(b)集中来自超过一个个体的HLA扩增子，并进行乳剂PCR;(c)利用焦磷酸测序并行地测定每个个体的HLA-A、HLA-B, HLA-C, DRBU DQAUDQBU DPAl和DPBl扩增子的序列；和(d)通过将HLA扩增子的序列与已知的HLA序列比较以确定哪些HLA等位基因存 在于个体中，为每个个体指定HLA等位基因。在根据本专利技术的优选的实施方式中，用于扩增 HLA扩增子的正向或反向引物具有表1中列出的引物的HLA杂交区域的序列。这样的引物 可以另外包含表1的引物的衔接头区域的序列。在进一步优选的实施方式中，所述引物还 可以包含表1中列出的引物的个体识别标签。在特别优选的实施方式中，所述引物具有表 1中所列的引物的序列。此外，本专利技术提供了包含用于获得HLA扩增子的引物对的试剂盒，来并行地测定 超过一个个体的 HLA 基因 HLA-A、HLA-B, HLA-C, DRBl、DQAl、DQBl、DPAl 和 DPBl 的 HLA 基 因型，其中所述引物对包含正向引物和反向引物来扩增HLA基因外显子，其中(i)所述正 向引物从5'到3'包含以下序列衔接头序列、分子识别序列和HLA序列；和(ii)所述反 向引物从5'到3'包含以下序列衔接头序列、分子识别序列和HLA序列。在优选的实施 方式中，所述试剂盒包含表1中所列的一种或更多种正向和反向引物。在其他优选的实施 方式中，所述试剂盒包含扩增外显子的引物对，用于对HLA基因HLA-A、HLA-B、HLA-C、DRB1、 DQAU DQBU DPAl和DPBl基因分型，其中每种引物对选自表1中所列的引物。本专利技术另外提供了包含一种或更多种引物对的试剂盒，其中每种引物对包含用于 获得HLA扩增子的正向引物，其具有表1中所列的引物的HLA杂交区域的序列；以及用于获 得HLA扩增子的反向引物，其具有表1中所列的引物的HLA杂交区域的序列。这样的引物 另外包含具有表1中所列序列的衔接头区域。在进一步优选的实施方式中，所述引物具有 表1中列出的引物的个体识别标签。在特别优选的实施方式中，所述正向引物具有表1中 所列的引物的序列，所述反向引物具有表1中所列的引物的序列。此外，本专利技术提供了试剂盒，其中所述试剂盒包含十五种HLA引物对，其中所述引 物对扩增HLA-A的外显子2、外显子3和外显子4 ；HLA-B的外显子2、外显子3和外显子4 ； HLA-C的外显子2、外显子3和外显子4 ；DRBl的外显子2、DPBl的外显子2、DPAl的外显子 2、DQA1的外显子2 JPDQBl的外显子2和外显子3。在优选的实施方式中，本专利技术提供了包 含至少六种引物对、或至少八、九、十、十一、十二、十三或十四种引物对的试剂盒。优选的， 所述引物对选自表1中所列的引物。此外，本专利技术提供了试剂盒，其中所述试剂盒对扩增HLA-A的外显子2、外显子3和 外显子4 ；HLA-B的外显子2、外显子3和外显子4 ；HLA-C的外显子2、外显子3和外显子4 ； DRBl的外显子2、DPBl的外显子2、DPAl的外显子2、DQAl的外显子2 ；和DQBl的外显子2 和外显子3的每种引物对包含多种引物对，其中扩增单独的感兴趣的外显子区域的所述多 种引物对具有相同的HLA杂交区域和相同的衔接头区域，但是具有不同的识别标签。在优 选的实施方式中，对于每个感兴趣的外显子区域存在着12种或更多的多种引物对，其中所 述引物对具有不同的多种识别标签。附图的简要描述附附图说明图1提供了本专利技术的正向和反向融合物引物的示意性的描绘。附图2提供了阅读长度的直方图。附图3显示了全部正向和反向阅读的阅读深度。专利技术的详细说明如在此使用的，术语“等位基因”是指基因的序列变体。一个或更多个遗传学差异 可以构成等位基因。对于HLA等位基因，一般地多个遗传学差异构成等位基因。HLA等位 基因序列的实例在Masonand Parham(1998)Tissue Antigens 51 :417-66 中阐述了，其列出 了 HLA-A、HLA-B 和 HLA-C 等位基因，以及在 Marsh et al. (1992) Hum. Immunol. 35 :1 中阐述 了，其列出了 DRA、DRB、DQAl、DQBl、DPAl 和 DPBl 的 II 类 HLA 等位基因。如在此使用的，术语“多态的，，和本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种并行地测定超过一个个体的ＨＬＡ基因ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＤＲＢ１、ＤＱＡ１、ＤＱＢ１、ＤＰＡ１和ＤＰＢ１的ＨＬＡ基因型的方法，所述方法包括：（ａ）对于每个个体，扩增包含多态性位点的ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＤＲＢ１、ＤＱＡ１、ＤＱＢ１、ＤＰＡ１和ＤＰＢ１基因的外显子，来获得每个个体的ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＤＲＢ１、ＤＱＡ１、ＤＱＢ１、ＤＰＡ１和ＤＰＢ１扩增子，其中每个扩增反应用正向引物和反向引物进行来扩增ＨＬＡ基因外显子，其中：（ｉ）正向引物包含以下序列，从５′到３′：衔接头序列、分子识别序列和ＨＬＡ杂交序列；和（ｉｉ）所述反向引物包含以下序列，从５′到３′：衔接头序列、分子识别序列和ＨＬＡ杂交序列；（ｂ）集中来自超过一个个体的ＨＬＡ扩增子，并进行乳剂ＰＣＲ；（ｃ）利用焦磷酸测序并行地测定每个个体的ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＤＲＢ１、ＤＱＡ１、ＤＱＢ１、ＤＰＡ１和ＤＰＢ１扩增子的序列；和（ｄ）通过将ＨＬＡ扩增子的序列与已知的ＨＬＡ序列比较以确定哪些ＨＬＡ等位基因存在于个体中，为每个个体指定ＨＬＡ等位基因。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2007.10.16 US 60/980393;2008.10.03 US 12/2456661.一种并行地测定超过一个个体的HLA基因HLA-A、HLA-B、HLA-C、DRBl、DQAl、DQBl、 DPAl和DPBl的HLA基因型的方法，所述方法包括(a)对于每个个体，扩增包含多态性位点的HLA-A、HLA-B,HLA-C, DRBU DQAU DQBU DPA1 和 DPB1 基因的外显子，来获得每个个体的 HLA-A、HLA-B、HLA-C、DRB1、DQA1、DQB1、DPA1 和DPB1扩增子，其中每个扩增反应用正向引物和反向引物进行来扩增HLA基因外显子，其 中⑴正向引物包含以下序列，从5'到3'衔接头序列、分子识别序列和HLA杂交序列；和(ii)所述反向引物包含以下序列，从5'到3'衔接头序列、分子识别序列和HLA杂 交序列；(b)集中来自超过一个个体的HLA扩增子，并进行乳剂PCR；(c)利用焦磷酸测序并行地测定每个个体的HLA-A、HLA-B,HLA-C, DRBl、DQAl、DQBl、 DPAl和DPBl扩增子的序列；和(d)通过将HLA扩增子的序列与已知的HLA序列比较以确定哪些HLA等位基因存在于 个体中，为每个个体指定HLA等位基因。2.权利要求1的方法，其中用于获得HLA扩增子的正向引物具有表1中所列的引物的 HLA结合区域的序列。3.权利要求2的方法，其中所述正向引物具有表1中所列的引物的序列。4.权利要求1的方法，其中用于获得HLA扩增子的反向引物具有表1中所列的引物的 HLA结合区域的序列。5.权利要求4的方法，其中所述反向引物具有表1中所列的引物的序列。6.权利要求1的方法，其中用于获得HLA扩增子的正向引物具有表1中所列的引物的 HLA杂交区域的序列；用于...

【专利技术属性】
技术研发人员：R·G·希古奇，G·本特利，H·A·埃利克，
申请(专利权)人：霍夫曼拉罗奇有限公司，
类型：发明
国别省市：CH