基于UMI单分子标签降噪技术的靶向测序检测肺癌基因的多重PCR引物、试剂盒及方法技术

本发明专利技术属于基因检测领域，特别涉及一种基于UMI(Unique molecular identifer)单分子标签降噪技术的靶向测序检测肺癌基因的多重PCR引物、试剂盒及方法。本发明专利技术具体公开了包含SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：48所示的靶向捕获肺癌常见驱动基因的特异性引物的多重PCR引物、含有上述引物的试剂盒及运用上述引物或试剂盒用一次PCR扩增反应捕获和扩增肺癌常见驱动基因的检测方法。本发明专利技术的带有UMI分子标签的多重PCR引物、试剂盒和检测方法，能够同时检测多个样本多个肺癌常见驱动基因，采用的UMI单分子标签降噪技术能够有效消除PCR过程中带来的假阳性，提高了检测灵敏度、准确率，同时降低了成本、简化了操作步骤。

【技术实现步骤摘要】
基于UMI单分子标签降噪技术的靶向测序检测肺癌基因的多重PCR引物、试剂盒及方法
本专利技术属于基因检测领域，特别涉及一种基于UMI(Uniquemolecularidentifer)单分子标签降噪技术的靶向测序检测肺癌基因的多重PCR引物、试剂盒及方法。
技术介绍
肺癌是数十年内全球最常见的癌症。世界卫生组织(WHO)将肺癌分为非小细胞肺癌和小细胞肺癌，非小细胞肺癌占全部肺癌病例的80％以上。随着奥巴马推出“精准医学计划”，中国也在大力推进靶向基因检测，与靶向治疗药物共同发展。FDA批准的主要肺癌驱动基因包括EGFR、KRAS、NRAS、BRAF、PIK3CA、ALK、ROS1等，相关的靶向药包括针对EGFR的EGFR酪氨酸激酶抑制剂(TKI)和抗EGFR抗体类；针对ALK的克唑替尼、ALK抑制剂；针对BRAF的BRAF抑制剂、MEK抑制剂等。此外，HER2、MAP2K1、MET、RET、TP53等基因也是肺癌常见突变基因，所列基因的变异情况对患者病情监测、预后评估、用药指导等具有临床指导意义。新一代测序技术(NextGenerationSequencing,NGS)是多基因多位点共同检测，样本量少、成本低、准确度高、敏感度高、特异性好的首选方法。在过去的十年间，二代测序仪制造商Illumina占据了大部分测序仪市场。然而，Illumina的二代测序仪文库富集以及测序仪的簇生成过程都是由PCR完成，一定程度上会出现基因组覆盖不均匀的测序噪音；此外，依赖聚合酶的边合成边测序难以保证碱基准确性，将产生碱基错误的测序噪音，很大程度上影响下游数据分析。由此降噪技术显得尤为重要。
技术实现思路
鉴于此，有必要针对上述问题提供一种基于UMI(Uniquemolecularidentifer)单分子标签降噪技术的靶向测序检测肺癌基因的多重PCR引物、试剂盒及方法。本专利技术能够同时检测多个样本多个肺癌驱动基因，且采用的UMI单分子标签降噪技术能够有效消除PCR过程中带来的假阳性，提高了检测灵敏度、准确率，同时降低了成本、简化了操作步骤。本专利技术是通过以下技术方案实现的：一种基于UMI单分子标签降噪技术的靶向测序检测肺癌基因的多重PCR引物，所述多重PCR引物包括24对特异性引物，所述每条PCR引物结构均包括UMI序列和特异性引物序列；所述特异性引物序列如SEQIDNO：1至SEQIDNO：48。进一步的，所述每条PCR引物结构还包括桥联序列；所述桥联序列为：CAGACGTGTGCTCTTCCGATCT。进一步的，所述特异性引物序列为经过特殊修饰的引物序列。进一步的，所述特异性引物序列的修饰方法为硫代修饰、磷酸化修饰、LNA和间臂修饰等中的一种或几种。进一步的，所述特异性引物的Tm值为60-68℃，优选62℃。进一步的，所述PCR引物的UMI(Uniquemolecularidentifer)序列为4-16个随机碱基。进一步的，所述PCR引物适用样本类型包括组织、FFPE、细胞等DNA丰度高的样本，还包括血浆血清、肺泡灌洗液和尿液等无细胞样本提取的DNA样本。一种基于UMI单分子标签降噪技术的靶向测序检测肺癌基因的试剂盒，所述试剂盒包括上述含SEQIDNO：1至SEQIDNO：48所示的特异性引物的PCR引物。一种基于UMI单分子标签降噪技术的靶向测序检测肺癌基因的方法，操作步骤包括：S3：用上述含SEQIDNO：1至SEQIDNO：48所示的特异性引物的PCR引物进行第一步靶向扩增，目的是让特异引物对目标片段进行靶向捕获。S5：将步骤(1)靶向捕获产物纯化后，进行第二步通用引物扩增富集文库，目的是将不同样本带上用于样本区分的分子标签(Barcode)并加上测序引物，得到测序文库。进一步的，所述第一步靶向扩增程序为(运行时长1小时)：进一步的，所述第二步文库富集程序为(运行时长1.5小时)：本专利技术有益效果：本专利技术的带有UMI序列的PCR引物的使用避免了低DNA上样量时PCR扩增错误导致的假阳性，通过后续UMI数据分析可以去除PCR扩增错误产生的重复序列，提高了检测灵敏度，尤其适合于肿瘤液体活检领域，体细胞突变的检测灵敏度可达到0.05％，远高于目前市面技术(1％)。本专利技术的PCR引物适用样本类型不仅包括组织、FFPE、细胞等DNA丰度高的样本，还包括血浆血清、肺泡灌洗液和尿液等无细胞样本提取的DNA。DNA上样量可低至1ng，远低于市面NGS文库构建方法的100ng-1ug。本专利技术的检测方法简单，两步PCR扩增法完成建库，总耗时为3小时，远低于市面技术8小时。本专利技术所采用的多重PCR捕获法与市面上常见建库方法(杂交捕获法)不一样，时间、试剂成本与操作简易性方面有显著性优势。对操作人员简单培训即可上岗。附图说明图1为本专利技术特异性引物特异性验证结果电泳图，其中M：Marker；N：阴性对照；P：阳性对照；1-3：血浆样本；4-6：肺泡灌洗液；7-9：石蜡组织样本。图2为本专利技术引物检测灵敏度验证结果电泳图，其中M：Marker；N：阴性对照；P：阳性对照；1-3：血浆样本(5ng、10ng和20ng)；4-6：肺泡灌洗液(5ng、10ng和20ng)；7-9：石蜡组织样本(5ng、10ng和20ng)。图3为本专利技术引物检测重复性验证结果电泳图，其中M：Marker；N：阴性对照；P：阳性对照；1-3分别为A操作员在a实验室检测血浆、肺泡灌洗液、石蜡组织样本结果；4-6分别为B操作员在b实验室检测血浆、肺泡灌洗液、石蜡组织样本结果。图4为本专利技术第一步靶向扩增的PCR引物结构示意图，其中，51：桥联序列；52：UMI序列；53：特异引物序列。图5为第二步文库富集引物结构示意图，其中，61：测序接头序列；62：index序列；63：桥联序列。具体实施方式为了更好地说明本专利技术所解决的问题、所采用的技术方案和所达到的效果，现结合具体实施例和相关资料进一步阐述。需要说明的是，本
技术实现思路
包含但不限于以下实施例及其组合实施方式。本专利技术实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购等途径获得的常规产品。实施例1一种基于UMI单分子标签的靶向测序肺癌基因的多重PCR特异性引物、试剂盒及方法1、引物的设计所述对肺癌驱动基因序列选自于UniversityofCaliforniaSantaCruz(UCSC)数据库，选用Primer3引物设计软件进行肿瘤驱动基因热点突变引物设计，设计范围的突变热点来源于CatalogueofSomaticMutationsinCancer(COMSIC)数据库，主要是与肺癌靶向药物疗效相关靶点。本专利技术对肺癌驱动基因(EGFR、KRAS、NRAS、BRAF、PIK3CA、ALK、ROS1)进行的引物设计共24对，每对特异性引物扩增目标区域大小为60-150bp，扩增子片段短，适用于短片段样本DNA尤其是血浆游离DNA和FFPE降解DNA的靶向捕获。参见图4，特异引物结构包括桥联序列、UMI序列和特异引物序列。特异引物上的桥联序列与带有Index测序接头的桥联序列相同或互补，用于第二步PCR反应时文库的富集(引物结构参见图5本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于UMI单分子标签降噪技术的靶向测序检测肺癌基因的多重PCR引物，其特征在于，所述每条PCR引物结构均包括UMI序列和特异性引物序列；所述特异性引物序列如SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：48所示。

【技术特征摘要】
1.一种基于UMI单分子标签降噪技术的靶向测序检测肺癌基因的多重PCR引物，其特征在于，所述每条PCR引物结构均包括UMI序列和特异性引物序列；所述特异性引物序列如SEQIDNO：1至SEQIDNO：48所示。2.根据权利要求1所述的多重PCR引物，其特征在于，所述PCR引物的UMI序列为4-16个随机碱基。3.根据权利要求1所述的多重PCR引物，其特征在于，所述每条PCR引物结构还包括桥联序列。4.根据权利要求1所述的多重PCR引物，其特征在于，所述特异性引物序列为经过修饰的引物序列；所述修饰方法为硫代修饰、磷酸化修饰、LNA和间臂修饰中的一种或几种。5.根据权利要求1所述的多重PCR引物，其特征在于，所述特异性引物的Tm值为60-68℃。6.根据权利要求1所述的多重PCR引物，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱奇，廖传荣，朱瑞娟，孟剑芳，郑泽鑫，
申请(专利权)人：广州奇辉生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44