本发明专利技术公开了一种鉴别三种药用石斛及其相似种的ISSR指纹图谱方法，包括以下步骤：样品预处理，DNA初步提取，DNA的检测及保存，ISSR‑PCR反应，电泳检测及基因分型能力评估，ISSR‑PCR指纹图谱的建立，未知种属的石斛样品种类的鉴定。本发明专利技术的优点在于：利用ISSR‑PCR技术对安徽霍山产三种药用石斛及其相似种进行种间和种下鉴别，建立了一个完整可靠的药用石斛ISSR—PCR反应系统(反应体系、反应程序和扩增引物)和分子标记指纹图谱，为研究药用石斛的鉴别和良种选育、提供分子水平上的参考和借鉴。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及兰科石斛属药用植物产品的鉴别方法
，尤其涉及一种鉴别三种药用石斛及其相似种的ISSR指纹图谱方法。
技术介绍
安徽省霍山地区主要产3种药用石斛，种名分别为：霍山石斛(DendrobiumhuoshanenseC.Z.TangetS.J.Cheng)(又称霍山米斛)、铁皮石斛(DendrobiumcandidumWall.exLindl.)(又称黑节草)和细茎石斛(Dendrobiummoniliforme(Linn.)Sw.)(又称铜皮石斛)。三者均为兰科石斛，属多年生草本植物，主要含有多糖、生物碱、联苄类和菲类等活性成分，具有抗肿瘤、免疫调节、抗氧化、扩张血管、降血糖等多种功效。三者共同被安徽省政府申报为地理标志产品“霍山石斛”(物种名称“霍山石斛”仅指一种，地理标志“霍山石斛”指代三种)。反向简单重复序列区间多态性分子标记技术(ISSR，intersimplesequencerepeat)，自1994年专利技术以来，便以其相对可靠的重复性、稳定性和丰富的多态性，广泛应用于种间和种下关系研究。本专利技术利用ISSR-PCR技术对安徽霍山产三种药用石斛及其相似种进行种间和种下鉴别，建立了一个完整可靠的药用石斛ISSR—PCR反应系统(反应体系、反应程序和扩增引物)和分子标记指纹图谱，为研究药用石斛的鉴别和良种选育、提供分子水平上的参考和借鉴。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种完整可靠且可为研究药用石斛的鉴别和良种选育提供分子水平上的参考和借鉴的鉴别三种药用石斛及其相似种的ISSR指纹图谱方法。为解决上述技术问题，本专利技术提供一种鉴别三种药用石斛及其相似种的ISSR指纹图谱方法，包括如下步骤：(1)：样品预处理将采集到的药用石斛材料用70％-75％的乙醇水溶液擦拭表面后，按同种类混合在一起，取8-12g，加入10-12mLDNA提取缓冲液，放在提前预冷至(-25)-(-20)℃的研钵中，用研棒将其研磨成糊状，再用移液枪吸180-200uL至离心管中；(2)：DNA初步提取①快速向上述离心管中加入400-500uL提前预热至60-65℃的DNA提取缓冲液，上下摇动混匀，60-65℃水浴1-1.5h后取出离心管，10000-12000r/min离心10-15min；②取上清液，加入等体积的氯仿与异戊醇混合液，上下颠倒离心管25-35次，10000-12000r/min离心10-15min，取上清液，再用氯仿与异戊醇混合液处理1-2次，10000-12000r/min离心；③取上清液0.8-1mL到离心管中，加入0.4-0.6mL提前预冷至(-25)-(-20)℃的异丙醇并混匀，静置10-15min，10000-12000r/min离心10-15min，弃上清，沉淀分别用70％-75％乙醇、无水乙醇各洗2-3次，60℃-65℃挥干乙醇5-6min，此沉淀即为基因组DNA初提物，最后，加100-150ul灭菌蒸馏水溶解DNA，即获得DNA提取液；(3)：DNA的检测及保存在得到DNA提取液后，对其纯度、浓度、完整性分别进行相应的检测及记录，再将检测完成的对应DNA提取液进行分管低温保存待用；(4)：ISSR-PCR反应①ISSR-PCR反应体系：模板10ng/L，引物0.3μM，Mg2+2.0mM，dNTP200μM，Taq聚合酶1U/20μl；②ISSR-PCR反应：以获取的DNA作为ISSR-PCR反应的模板，在PCR仪上进行ISSR-PCR扩增反应；第一阶段：反应体系中加入第一组引物，94℃预变性8min，94℃变性45s，58℃退火45s，72℃延伸2min，扩增10个循环；第二阶段：在上述反应体系中加入第二组引物，94℃变性45s，58-50℃退火45s，72℃延伸2min，扩增25个循环，梯度退火，最后于72℃终延伸8min；(5)：电泳检测及基因分型能力评估取3-5μl扩增产物用1.0％-1.5％琼脂糖凝胶，5-10V/cm恒压电泳检测，溴化乙锭染色后用凝胶成像系统对电泳检测结果进行拍照，获取相应电泳检测结果图，并对引物的基因分型能力进行评估分析，根据基因分型能力评估分析结果，确定该电泳检测结果是否可有效区分全部样品以确保后续建立的指纹图谱的可靠性；(6)：ISSR-PCR指纹图谱的建立当基因分型能力评估结果显示电泳检测结果可有效区分全部样品后，该电泳检测结果图即为所选择鉴别的不同种药用石斛的ISSR-PCR指纹图谱；(7)：未知种属的石斛样品种类的鉴定把未知种属的石斛样品按照上述步骤(1)-(6)建立其相应的ISSR-PCR指纹图谱，再将其与已建立的已知种属的药用石斛的ISSR-PCR指纹图谱的信息相比较，当其与某一泳道的条带信息的吻合度达98％以上，即可判定为同一种；当其与某一泳道的条带信息的吻合度介于95％-98％之间，则可确定为近似种；当其与所有条带的吻合度都低于95％，即可判定不属于已知的任何一种药用石斛种类。优选地，所述步骤(1)中药用石斛的种类分别为霍山石斛、霍山铁皮石斛、霍山细茎石斛及其相似种；所述相似种又进一步包括云南铁皮石斛、浙江铁皮石斛、河南石斛、安徽曲茎石斛、霍山细茎石斛♂×霍山铁皮石斛♀杂交种、霍山石斛♂×霍山细茎石斛杂交种。优选地，所述步骤(2)中氯仿与异戊醇混合液为体积比分别为24:1的氯仿与异戊醇混合液。优选地，所述步骤(1)和步骤(2)中DNA提取缓冲液的配方为：0.1mol·L-1Tris-HCl(pH8.0)，0.02mol·L-1EDTA(pH8.0)，1.5mol·L-1NaCl，2％PVP40(W/V)，2％CTAB(W/V)，临用前加3％的β-巯基乙醇。优选地，所述步骤(2)中水浴过程要同时对离心管中的混合液进行不间断的混匀，所述不间断的混匀方式为：水浴的前10min，每隔3min摇动离心管；剩余时间内，每隔10min上下颠倒离心管2-4次。优选地，所述步骤(3)中利用紫外分光光度法进行DNA提取液的纯度和浓度检测，利用0.5％琼脂糖凝胶电泳进行DNA提取液的完整性检测。优选地，所述步骤(3)中分管低温保存方法为：先将检测完成的DNA提取液进行分管，即用移液枪吸取100uL检测完成的DNA提取液至1.5mL离心管中，再重复操作至无剩余DNA提取液，再将分装完成的各离心管置于-20℃冰箱中保存。优选地，所述步骤(4)中第一组引物为不含锚定碱基的两个引物序列：(AT)8，(CT)8；第二组引物为含两个锚定碱基的两个引物序列：(AT)8CG,(CT)8GA。优选地，所述步骤(5)中各引物的基因分型能力的评估分析方法为：先根据电泳检测结果图上相同条带的有或无，统计得到所有位点的二元数据，再根据该位点具有条带的样本占总样本的比率P值和公式Ib＝1－2|0.5－P|来计算条带信息量Ib值，而一条引物的基因分型能力则可以用该引物扩增的所有位点的Ib值之和来评价，即Rp＝ΣIb，当0.5≤Rp/选择的位点数≤1时，该引物具备可区分所有样品的基因分型能力，其中，Rp/选择的位点数的比值越大，其区分能力越强；所述二元数据的统计方法为：有条带的记录为1，无条带记录为0，而“有”带或“无”带则采用Bandscan5.0本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种鉴别三种药用石斛及其相似种的ISSR指纹图谱方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)：样品预处理将采集到的药用石斛材料用70％‑75％的乙醇水溶液擦拭表面后，按同种类混合在一起，取8‑12g，加入10‑12mL DNA提取缓冲液，放在提前预冷至(‑25)‑(‑20)℃的研钵中，用研棒将其研磨成糊状，再用移液枪吸180‑200uL至离心管中；(2)：DNA初步提取①快速向上述离心管中加入400‑500uL提前预热至60‑65℃的DNA提取缓冲液，上下摇动混匀，60‑65℃水浴1‑1.5h后取出离心管，10000‑12000r/min离心10‑15min；②取上清液，加入等体积的氯仿与异戊醇混合液，上下颠倒离心管25‑35次，10000‑12000r/min离心10‑15min，取上清液，再用氯仿与异戊醇混合液处理1‑2次，10000‑12000r/min离心；③取上清液0.8‑1mL到离心管中，加入0.4‑0.6mL提前预冷至(‑25)‑(‑20)℃的异丙醇并混匀，静置10‑15min，10000‑12000r/min离心10‑15min，弃上清，沉淀分别用70％‑75％乙醇、无水乙醇各洗2‑3次，60℃‑65℃挥干乙醇5‑6min，此沉淀即为基因组DNA初提物，最后，加100‑150ul灭菌蒸馏水溶解DNA，即获得DNA提取液；(3)：DNA的检测及保存在得到DNA提取液后，对其纯度、浓度、完整性分别进行相应的检测及记录，再将检测完成的对应DNA提取液进行分管低温保存待用；(4)：ISSR‑PCR反应①ISSR‑PCR反应体系：模板10ng/L，引物0.3μM，Mg2+2.0mM，dNTP 200μM，Taq聚合酶1U/20μl；②ISSR‑PCR反应：以获取的DNA作为ISSR‑PCR反应的模板，在PCR仪上进行ISSR‑PCR扩增反应；第一阶段：反应体系中加入第一组引物，94℃预变性8min，94℃变性45s，58℃退火45s，72℃延伸2min，扩增10个循环；第二阶段：在上述反应体系中加入第二组引物，94℃变性45s，58‑50℃退火45s，72℃延伸2min，扩增25个循环，梯度退火，最后于72℃终延伸8min；(5)：电泳检测及基因分型能力评估取3‑5μl扩增产物用1.0％‑1.5％琼脂糖凝胶，5‑10V/cm恒压电泳检测，溴化乙锭染色后用凝胶成像系统对电泳检测结果进行拍照，获取相应电泳检测结果图，并对引物的基因分型能力进行评估分析，根据基因分型能力评估分析结果，确定该电泳检测结果是否可有效区分全部样品；(6)：ISSR‑PCR指纹图谱的建立当基因分型能力评估结果显示电泳检测结果可有效区分全部样品后，该电泳检测结果图即为所选择鉴别的不同种药用石斛的ISSR‑PCR指纹图谱；(7)：未知种属的石斛样品种类的鉴定把未知种属的石斛样品按照上述步骤(1)‑(6)建立其相应的ISSR‑PCR指纹图谱，再将其与已建立的已知种属的药用石斛的ISSR‑PCR指纹图谱的信息相比较，当其与某一泳道的条带信息的吻合度达98％以上，即可判定为同一种；当其与某一泳道的条带信息的吻合度介于95％‑98％之间，则可确定为近似种；当其与所有条带的吻合度都低于95％，即可判定不属于已知的任何一种药用石斛种类。...
【技术特征摘要】
1.一种鉴别三种药用石斛及其相似种的ISSR指纹图谱方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)：样品预处理将采集到的药用石斛材料用70％-75％的乙醇水溶液擦拭表面后，按同种类混合在一起，取8-12g，加入10-12mLDNA提取缓冲液，放在提前预冷至(-25)-(-20)℃的研钵中，用研棒将其研磨成糊状，再用移液枪吸180-200uL至离心管中；(2)：DNA初步提取①快速向上述离心管中加入400-500uL提前预热至60-65℃的DNA提取缓冲液，上下摇动混匀，60-65℃水浴1-1.5h后取出离心管，10000-12000r/min离心10-15min；②取上清液，加入等体积的氯仿与异戊醇混合液，上下颠倒离心管25-35次，10000-12000r/min离心10-15min，取上清液，再用氯仿与异戊醇混合液处理1-2次，10000-12000r/min离心；③取上清液0.8-1mL到离心管中，加入0.4-0.6mL提前预冷至(-25)-(-20)℃的异丙醇并混匀，静置10-15min，10000-12000r/min离心10-15min，弃上清，沉淀分别用70％-75％乙醇、无水乙醇各洗2-3次，60℃-65℃挥干乙醇5-6min，此沉淀即为基因组DNA初提物，最后，加100-150ul灭菌蒸馏水溶解DNA，即获得DNA提取液；(3)：DNA的检测及保存在得到DNA提取液后，对其纯度、浓度、完整性分别进行相应的检测及记录，再将检测完成的对应DNA提取液进行分管低温保存待用；(4)：ISSR-PCR反应①ISSR-PCR反应体系：模板10ng/L，引物0.3μM，Mg2+2.0mM，dNTP200μM，Taq聚合酶1U/20μl；②ISSR-PCR反应：以获取的DNA作为ISSR-PCR反应的模板，在PCR仪上进行ISSR-PCR扩增反应；第一阶段：反应体系中加入第一组引物，94℃预变性8min，94℃变性45s，58℃退火45s，72℃延伸2min，扩增10个循环；第二阶段：在上述反应体系中加入第二组引物，94℃变性45s，58-50℃退火45s，72℃延伸2min，扩增25个循环，梯度退火，最后于72℃终延伸8min；(5)：电泳检测及基因分型能力评估取3-5μl扩增产物用1.0％-1.5％琼脂糖凝胶，5-10V/cm恒压电泳检测，溴化乙锭染色后用凝胶成像系统对电泳检测结果进行拍照，获取相应电泳检测结果图，并对引物的基因分型能力进行评估分析，根据基因分型能力评估分析结果，确定该电泳检测结果是否可有效区分全部样品；(6)：ISSR-PCR指纹图谱的建立当基因分型能力评估结果显示电泳检测结果可有效区分全部样品后，该电泳检测结果图即为所选择鉴别的不同种药用石斛的ISSR-PCR指纹图谱；(7)：未知种属的石斛样品种类的鉴定把未知种属的石斛样品按照上述步骤(1)-(6)建立其相应的ISSR-PCR指纹图谱，再将其与已建立的已知种属的药用石斛的ISSR-PCR指纹图谱的信息相比较，当其与某一泳道的条带信息的吻合度达98％以上，即可判定为同一种；当其与某一泳道的条带信息的吻合度介于95％-98％之间，则可确定为近似种；当其与所有条带的吻合度都低于95％，即可判定不属于已知的任何一种药用石斛种类。2.根据权利要求1所述的一种鉴别三种药用石斛及其相似种的ISSR指纹图...
【专利技术属性】
技术研发人员：邓辉，陈乃富，韦传宝，杨国栋，李艳，
申请(专利权)人：皖西学院，
类型：发明
国别省市：安徽;34
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