用于产生己二酸和其他化合物的微生物制造技术

本发明专利技术提供了一种非天然存在的微生物生物体，其具有己二酸、6‑氨基己酸或己内酰胺途径。所述微生物生物体含有至少一种编码己二酸、6‑氨基己酸或己内酰胺途径中各自的酶的外源性核酸。本发明专利技术另外提供了产生己二酸、6‑氨基己酸或己内酰胺的方法。该方法可以包括在产生己二酸、6‑氨基己酸或己内酰胺的条件下和足以产生己二酸、6‑氨基己酸或己内酰胺的时间内培养产生己二酸、6‑氨基己酸或己内酰胺的微生物生物体，其中所述微生物生物体以足以产生各自产物的量表达至少一种编码己二酸、6‑氨基己酸或己内酰胺途径酶的外源性核酸。

【技术实现步骤摘要】
本申请是申请日为2009年3月27日、优先权日为2008年3月27日、申请号为201310408211.4、专利技术名称为“用于产生己二酸和其他化合物的微生物”的专利技术专利申请的分案申请。其中，申请号为201310408211.4的专利技术专利申请是申请日为2009年3月27日、优先权日为2008年3月27日、申请号为200980119404.X、专利技术名称为“用于产生己二酸和其他化合物的微生物”的专利技术专利申请的分案申请。本申请要求于2008年3月27日申请的美国临时系列号61/040,059的优先权权益，该申请的全部内容通过引用合并于此。
本专利技术总体上涉及生物合成方法，且更具体地涉及具有己二酸、6-氨基己酸和己内酰胺生物合成能力的生物体。
技术介绍
己二酸，一种分子量为146.14的二羧酸，是一种具有商业意义的化合物。其主要用途是制备尼龙6,6，一种通过将己二酸与环己二胺缩合制备的线性聚酰胺，其主要用于制造不同种类的纤维。己二酸的其他用途包括其在增塑剂、不饱和聚酯和聚酯多元醇中的用途。其他用途包括用于制备聚氨酯、润滑剂组分，和作为调味剂和胶凝助剂用作食品成分。过去，己二酸使用氧化作用由各种脂肪制备。目前用于己二酸合成的商业方法依靠使用过量的浓硝酸氧化KA油——一种环己酮(酮或K组分)和环己醇(醇或A组分)的混合物，或氧化纯环己醇。此方案有几种变型，其区别在于产生KA或环己醇的途径。例如，苯酚是KA油制备中的替代原料，并且已经描述了用于从苯酚合成己二酸的方法。此方法的其他方式倾向于使用除硝酸以外的氧化剂，诸如过氧化氢、空气或氧。己内酰胺是一种有机化合物，其是6-氨基己酸(ε-氨基己酸、氨基己酸)的内酰胺。或者其可以被认为是己酸的环酰胺。己内酰胺的主要工业应用是作为制备尼龙-6的单体。大多数己内酰胺使用硫酸羟铵经肟化方法然后使用Beckmann重排工艺步骤通过催化重排合成自环己酮。因此，存在着用于有效地制备商业数量的化合物诸如己二酸和己内酰胺的可替代方法的需求。本专利技术满足了这种需求并还提供了相关的优势。
技术实现思路
本专利技术提供了具有己二酸、6-氨基己酸或己内酰胺途径的非天然存在的微生物生物体。该微生物生物体含有至少一种编码己二酸、6-氨基己酸或己内酰胺途径中各自的酶的外源性核酸。本专利技术还提供了一种产生己二酸、6-氨基己酸或己内酰胺的方法。该方法可以包括在产生己二酸、6-氨基己酸或己内酰胺的条件下和足以产生己二酸、6-氨基己酸或己内酰胺的时间内培养产生己二酸、6-氨基己酸或己内酰胺的微生物生物体，其中所述微生物生物体以足以产生各自产物的量表达至少一种编码己二酸、6-氨基己酸或己内酰胺途径酶的外源性核酸。附图说明图1显示在产黄青霉菌(Penicillium chrysogenum)的过氧化酶体中降解己二酸的示例性途径。图2显示经逆降解途径形成己二酸的示例性途径。对于己二酰-CoA至己二酸的最终转变提供了几种选择。图3显示经3-氧代己二酸途径形成己二酸的示例性途径。图4显示己二酸合成和还原性TCA循环的3-氧代己二酸途径的最后三个步骤的类似酶化学。图5显示经顺,顺-己二烯二酸从葡萄糖合成己二酸的示例性途径。生物合成中间体(缩写):D-赤藓糖4-磷酸(E4P)、磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)、3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸7-磷酸(DAHP)、3-脱氢奎尼酸(DHQ)、3-脱氢莽草酸(DHS)、原儿茶酸(PCA)。酶(编码基因)或反应条件：(a)DAHP合成酶(aroFFBR)、(b)3-脱氢奎尼酸合成酶(aroB)、(c)3-脱氢奎尼酸脱水酶(aroD)、(d)DHS脱水酶(aroZ)、(e)原儿茶酸脱羧酶(aroY)、(f)儿茶酚1,2-双加氧酶(catA)、(g)10％Pt/C,H2,3400kPa,25℃。附图取自Niu等，Biotechnol.Prog.18:201-211(2002))。图6显示使用α-酮戊二酸作为起点经α-酮己二酸合成己二酸的示例性途径。图7显示使用赖氨酸作为起点合成己二酸的示例性途径。图8显示使用己二酰-CoA作为起点的示例性己内酰胺合成途径。图9显示使用α-酮己二酸作为起点的示例性己二酸合成途径。具体实施方式本专利技术涉及具有己二酸、6-氨基己酸或己内酰胺的生物合成性制备能力的细胞和生物体的设计和产生。本文所述的结果表明代谢途径可以被设计和重组改造，从而在大肠杆菌(Escherichia coli)和其他细胞或生物体中实现己二酸、6-氨基己酸或己内酰胺的生物合成。通过构建具有设计的代谢基因型的菌株可以确认己二酸、6-氨基己酸和己内酰胺的生物合成性制备。这些代谢改造的细胞或生物体还可以进行适应进化以进一步增加己二酸、6-氨基己酸或己内酰胺的生物合成，包括在接近理论最大生长的条件下。如本文所公开的，描述了许多用于产生己二酸、6-氨基己酸和己内酰胺的代谢途径。发现两种途径——逆向己二酸降解途径和3-氧代己二酸途径——在下列方面是有益的：(i)己二酸产率(以葡萄糖计，92％摩尔产率)，(ii)对于己二酸合成不需要氧，(iii)相关的能量学，和(iv)产生作为单一发酵产物的己二酸的理论能力。还描述了通过α-酮己二酸或赖氨酸产生己二酸的代谢途径，但其产率较低，并且需要通气以达到最大产量。本文还公开了用于从己二酰-CoA产生6-氨基己酸或己内酰胺或两者的途径，所述己二酰-CoA是逆降解途径中的前体。如本文所公开的，描述了许多生物合成己二酸的示例性途径。一种示例性途径包括经依赖于己二酸降解的可逆性的途径的己二酸合成，如在生物体诸如产黄青霉菌中所描述(参见实施例I和II)。第二种示例性途径需要形成3-氧代己二酸，然后使其还原、脱水和再次还原以形成己二酸(参见实施例III和IV)。使用这两种途径的任一种的己二酸产率为0.92摩尔/摩尔消耗的葡萄糖。为了达到这些理论最大产率，不需要摄取氧，并且在厌氧条件下的能量学有利于生长和产物分泌。从葡萄糖来源的顺,顺-己二烯二酸产生己二酸的方法以前有所描述(Frost等，美国专利号5,487,987，于1996年1月30日授权)(参见实施例V)。对本文公开的实施方案相对于此先前描述的方法的优势进行了讨论。通过α-酮己二酸(实施例VI)或赖氨酸(实施例VII)前体产生己二酸的代谢途径的产率较低，并且需要通气以达到最大产量。描述了从己二酰-CoA产生6-氨基己酸或己内酰胺或两者的途径，所述己二酰-CoA是逆降解途径中的前体(参见实施例VIII和IX)。用于产生己二酸的其他途径描述在实施例X和XI中。描述了构建具有这些能力的微生物所需的示例性基因和酶以及克隆和转化、监测产物形成和使用改造的微生物用于生产的方法。如本文所公开的，描述了使用葡萄糖/蔗糖作为碳底物的己二酸合成的6种不同的途径。对于所有最大产率计算，在给定途径中缺少的反应加入至SimPheny中的大肠杆菌化学计算网络中，其类似于以前所述的一种网络(Reed等,Genome Biol.4:R54(2003))。己二酸在生理条件下是一种带电分子，并且其被假设需要以基于质子的同向转运系统形式的能量以被分泌出网络。如果在中性或接近中性pH下进行发酵，则此转运系统在热力学上是可行的。低pH己二酸形成将需要ATP-依赖性输本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种非天然存在的微生物生物体，包括具有己内酰胺途径的微生物生物体，所述途径包含以足以产生己内酰胺的量表达的至少一种编码己内酰胺途径酶的外源性核酸，所述己内酰胺途径包括CoA‑依赖性醛脱氢酶；转氨酶或6‑氨基己酸脱氢酶；和酰胺水解酶。

【技术特征摘要】
2008.03.27 US 61/040,0591.一种非天然存在的微生物生物体，包括具有己内酰胺途径的微生物生物体，所述途径包含以足以产生己内酰胺的量表达的至少一种编码己内酰胺途径酶的外源性核酸，所述己内酰胺途径包括CoA-依赖性醛脱氢酶；转氨酶或6-氨基己酸脱氢酶；和酰胺水解酶。2.权利要求1所述的非天然存在的微生物生物体，进一步包含己二酰-CoA途径。3.权利要求2所述的非天然存在的微生物生物体，所述己二酰-CoA途径包括琥珀酰-CoA:乙酰-CoA酰基转移酶、3-羟酰-CoA脱氢酶、3-羟基己二酰-CoA脱水酶和5-羧基-2-戊烯酰-CoA还原酶。4.权利要求2所述的非天然存在的微生物生物体，所述己二酰-CoA途径包含己二酸途径和选自己二酰-CoA合成酶、磷酸己二酰转移酶/己二酸激酶、己二酰-CoA:乙酰-CoA转移酶和己二酰-CoA水解酶的酶。5.权利要求4所述的非天然存在的微生物生物体，所述己二酸途径包括琥珀酰-CoA:乙酰-CoA酰基转移酶、3-氧代己二酰-CoA转移酶、3-氧代己二酸还原酶、3-羟基己二酸脱水酶和2-烯酸还原酶。6.权利要求1所述的非天然存在的微生物生物体，其中所述微生物生物体包含两种各自编码己内酰胺途径酶的外源性核酸。7.权利要求1所述的非天然存在的微生物生物体，其中所述微生物生物体包含三种各自编码己内酰胺途径酶的外源性核酸。8.权利要求7所述的非天然存在的微生物生物体，其中所述三种外源性核酸编码CoA-依赖性醛脱氢酶、转氨酶和酰胺水解酶。9.权利要求7所述的非天然存在的微生物生物体，其中所述三种外源性核酸编码CoA-依赖性醛脱氢酶、6-氨基己酸脱氢酶和酰胺水解酶。10.权利要求1所述的非天然存在的微生物生物体，其中所述至少一种外源性核酸是异源核酸。11.权利要求1所述的非天然存在的微生物生物体，其中所述非天然存在的微生物生物体在基本上厌氧的培养基中。12.一种产生己内酰胺的方法，包括在产生己内酰胺的条件下和足以产生己内酰胺的时间内培养具有己内酰胺途径的非天然存在的微生物生物体，所述途径包含以足以产生己内酰胺的量表达的至少一种编码己内酰胺途径酶的外源性核酸，所述己内酰胺途径包括CoA-依赖性醛脱氢酶；转氨酶或6-氨基己酸脱氢酶；和酰胺水解酶。13.权利要求12所述的方法，进一步包含己二酰-CoA途径。14.权利要求13所述的方法，所述己二酰-CoA途径包括琥珀酰-CoA:乙酰-CoA酰基转移酶、3-羟酰-CoA脱氢酶、3-羟基己二酰-CoA脱水酶和5-羧基-2-戊烯酰-CoA还原酶。15.权利要求13所述的方法，所述己二酰-CoA途径包含己二酸途径和选自己二酰-CoA合成酶、磷酸己二酰转移酶/己二酸激酶、己二酰-CoA:乙酰-CoA转移酶和己二酰-CoA水解酶的酶。16.权利要求15所述的非天然存在的微生物生物体，所述己二酸途径包括琥珀酰-CoA:乙酰-CoA酰基转移酶、3-氧代己二酰-CoA转移酶、3-氧代己二酸还原酶、3-羟基己二酸脱水酶和2-烯酸还原酶。17.权利要求12所述的方法，其中所述非天然存在的微生物生物体在基本上厌氧的培养基中。18.权利要求12所述的方法，其中所述微生物生物体包含两种各自编码己内酰胺途径酶的外源性核酸。19.权利要求12所述的方法，其中所述微生物生物体包含三种各自编码己内酰胺途径酶的外源性核酸。20.权利要求19所述的方法，其中所述三种外源性核酸编码CoA-依赖性醛脱氢酶、转氨酶和酰胺水解酶。21.权利要求19所述的方法，其中所述三种外源性核酸编码CoA-依赖性醛脱氢酶、6-氨基己酸脱氢酶和酰胺水解酶。22.权利要求12所述的方法，其中所述至少一种外源性核酸是异源核酸。23.一种非天然存在的微生物生物体，包括具有己二酸途径的微生物生物体，所述途径包含以足以产生己二酸的量表达的至少一种编码己二酸途径酶的外源性核酸，所述己二酸途径包括α-酮己二酰-CoA合成酶、磷酸酮己二酰转移酶/α-酮己二酸激酶或α-酮己二酰-CoA:乙酰-CoA转移酶；2-羟基己二酰-CoA脱氢酶；2-羟基己二酰-CoA脱水酶；5-羧基-2-戊烯酰-CoA还原酶；和己二酰-CoA合成酶、磷酸己二酰转移酶/己二酸激酶、己二酰-CoA:乙酰-CoA转移酶或己二酰-CoA水解酶。24.权利要求23所述的非天然存在的微生物生物体，其中所述微生物生物体包含两种各自编码己二酸途径酶的外源性核酸。25.权利要求23所述的非天然存在的微生物生物体，其中所述微生物生物体包含三种各自编码己二酸途径酶的外源性核酸。26.权利要求23所述的非天然存在的微生物生物体，其中所述微生物生物体包含四种各自编码己二酸途径酶的外源性核酸。27.权利要求23所述的非天然存在的微生物生物体，其中所述微生物生物体包含五种各自编码己二酸途径酶的外源性核酸。28.权利要求27所述的非天然存在的微生物生物体，其中所述五种外源性核酸编码α-酮己二酰-CoA合成酶、磷酸酮己二酰转移酶/α-酮己二酸激酶或α-酮己二酰-CoA:乙酰-CoA转移酶；2-羟基己二酰-CoA脱氢酶；2-羟基己二酰-CoA脱水酶；5-羧基-2-戊烯酰-CoA还原酶；和己二酰-CoA合成酶、磷酸己二酰转移酶/己二酸激酶、己二酰-CoA:乙酰-CoA转移酶或己二酰-CoA水解酶。29.权利要求23所述的非天然存在的微生物生物体，其中所...

【专利技术属性】
技术研发人员：A·P·博加德，普里蒂·法克雅，罗宾·E·奥斯特豪特，
申请(专利权)人：基因组股份公司，
类型：发明
国别省市：美国;US