一种混合诱变蜡状芽孢杆菌产磷脂酶C的方法技术

本发明专利技术公开了一种混合诱变蜡状芽孢杆菌产磷脂酶C的方法。其特征是：以蜡状芽孢杆菌作为出发菌株，将其单胞子菌悬液依次进行紫外线和硫酸二乙酯诱变剂进行混合诱变，得到一株高产磷脂酶C的菌株，然后确定了该菌珠的最适培养条件。利用本发明专利技术诱变得到的菌株及培养方法生产的磷脂酶C，其沉淀圈直径达33.12mm，磷脂酶C活力达26.23U/mL，且操作简单，效率高。在油脂领加工域采用磷脂酶C脱胶，可使磷脂转化成DAG，从而提高油脂中的功能成分，又可降低油脂中的磷脂含量。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于微生物诱变
，涉及一种混合诱变蜡状芽孢杆菌产磷脂酶C的方法。
技术介绍
磷脂酶C(PLC)是一类可将磷脂C3磷脂酞键催化水解的水解酶，并含有Ca2+、Zn2+、Mg2+等金属诱导的酶，通过对各种磷脂的催化水解作用来影响其反应过程，包括代谢细胞和传递信息，裂解磷脂、乳化性的减少等。PLC在细菌、酵母菌、粘菌、果蝇、蛙及各种哺乳动物体中己发现有20多个不同结构的PLC分子，其基因主要存在于动物、植物及微生物的组织和细胞中。微生物所产的PLC，不仅产量高，而且在分离纯化方面也比较容易。由于蜡状芽孢杆菌生产的PLC能特异性水解PC、PE和PI，因此，适合作为用于植物油脱胶PLC的生产菌种。近几年，PLC作为新兴的脱胶酶需求量较大，关于微生物PLC在食品加工、油脂精炼、化妆品及药品生产等工业领域中的应用已引起国内外研究人员的广泛兴趣，但目前还没有商业化的工业用PLC制剂生产，因此，对如何提高PLC产量及如何提纯PLC更加的关注。而在PLC的芽孢杆菌来源相关报道中，蜡状芽孢杆菌和苏云金牙孢杆菌来源的PLC的相关文献和专利报道较多，但未有关于混合诱变蜡状芽孢杆菌的相关报道。在本专利技术中，产PLC的微生物蜡状芽孢杆菌经过物理、化学混合诱变，最终得到一株高产PLC菌株，进行发酵培养产PLC，随后对PLC粗酶液进行分离纯化，得到纯化PLC。
技术实现思路
本专利技术是通过紫外线和硫酸二乙酯诱变剂进行混合诱变，然后对其发酵培养条件进行优化，得到一株高产PLC菌株并优化其培养条件的方法，经纯化后的PLC活力较高，为PLC的工业化生产提供基础，且酶活较高，操作简单，效率高。【具体实施方式】【具体实施方式】一:步骤一:以蜡状芽孢杆菌CICC-21688接种在PDA斜面培养基上，28°C恒温培养7天，待孢子成熟后，加入5mL0.9 %无菌生理盐水，用接种环将孢子轻轻刮下，倒入盛有玻璃珠的试管中，充分震荡，使孢子充分打散，成为单孢子菌悬液，用生理盐水稀释至108个/mL;然后用紫外线与硫酸二乙酯依次处理出发菌株蜡状芽孢杆菌，取紫外线照射30、60、90、120、150s后的菌悬液，接种到发酵培养基上，30°C避光培养24h，8000r/min离心15min，去除上清液，制成菌悬液，取4mL上述菌悬液加入16mL磷酸缓冲液，再加DES乙醇溶液(0.5g/mL)震荡处理，选取震荡时间为25、30、35、40、45min。震荡结束后加入0.5mL25%的硫代硫酸钠溶液终止反应;再对突变菌株进行筛选，挑取24株突变菌和2株对照菌的单菌落，将其分别接入种子培养基中，28°C培养24h后，分别在接入发酵培养基，对其进行摇瓶初筛、复筛，筛选依据为PLC酶活大小，最后得到一株稳定产PLC酶活较高的突变株；步骤二:将筛选出的一株稳定菌株，在基础培养基中进行培养，培养基pH(5.0、6.0、7.0、8.0、9.0)，按照一定的接种量(1%、2%、3%、4%、5%)、装液量(601111725011^、80mL/250mL、100mL/250mL、120mL/250mL、140mL/250mL)、摇床转速(120、140、160、180、20(^/11^11)、发酵温度(26、28、30、32、34°0、发酵时间(14、18、22、26、3011)进行培养，测沉淀圈直径。【具体实施方式】二:本实施方法与具体实施方法一不同点在于步骤一中选择紫外线照射时间为30、60、90s，硫酸二乙酯诱变剂处理25、30、35min，测沉淀圈直径，其它组成和步骤与具体实施方法一相同。【具体实施方式】三:本实施方法与具体实施方法一不同点在于步骤二中选取培养基pH为7.0,8.0,9.0,测沉淀圈直径，其它组成和步骤与具体实施方法一相同。【具体实施方式】四:本实施方法与具体实施方法一不同点在于步骤二中选取最佳接种量为1%、2%、3%，测沉淀圈直径，其它组成和步骤与具体实施方法一相同。【具体实施方式】五:本实施方法与具体实施方法一不同点在于步骤二中选取装液量为80mL/250mL、100mL/250mL、120mL/250mL，测沉淀圈直径，其它组成和步骤与具体实施方法一相同。【具体实施方式】六:本实施方法与具体实施方法一不同点在于步骤二中选取摇床转速为140、160、180r/min，测沉淀圈直径，其它组成和步骤与具体实施方法一相同。【具体实施方式】七:本实施方法与具体实施方法一不同点在于步骤二中选取发酵温度为28、30、32°C，测沉淀圈直径，其它组成和步骤与具体实施方法一相同。【具体实施方式】八:本实施方法与具体实施方法一不同点在于步骤二中选取发酵时间为14、18、22h，测沉淀圈直径，其它组成和步骤与具体实施方法一相同。【主权项】1.利用物理、化学诱变蜡状芽孢杆菌产磷脂酶C的方法，其特征在于:以蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereuS)CICC-21688作为出发菌株，将其单胞子菌悬液依次进行物理和化学诱变，得到一株高产磷脂酶C的菌株，然后确定了该菌株的最适培养条件。2.根据权利要求1所述的利用物理、化学诱变得到一株高产磷脂酶C的菌株，确定了该菌株的最适培养条件。一种混合诱变蜡状芽孢杆菌产磷脂酶C的方法，其特征在于以下步骤: 步骤一:首先制备单胞子菌悬液，然后用紫外与硫酸二乙酯依次处理出发菌株蜡状芽孢杆菌，取紫外线照射30、60、90、120、150 s后沉淀圈直径最大的菌悬液，接种到发酵培养基上，然后制备菌悬液，取4mL上述菌悬液加入16mL磷酸缓冲液，再加DES乙醇溶液(0.5g/mL)震荡处理，选取震荡时间为25、30、35、40、45min，震荡结束后加入0.5mL25 %的硫代硫酸钠溶液终止反应，筛选出一株稳定的突变菌株； 步骤二:将筛选出的一株稳定菌株，在基础培养基中进行培养，培养基pH( 5.0、6.0、7.0、8.0、9.0)，按照一定的接种量(1%、2%、3%、4%、5%)、装液量(60111172501^、8011117250mL、100mL/250mL、120mL/250mL、140mL/250mL)、摇床转速(120、140、160、180、200r/min)、发酵温度(26、28、30、32、34°C)、发酵时间(14、18、22、26、30h)进行培养，测沉淀圈直径。3.根据权利要求2所述的一种混合诱变蜡状芽孢杆菌产磷脂酶C的方法，其特征在于步骤一中紫外线照射时间为30、60、908，硫酸二乙酯诱变剂处理25、30、351!^11。4.根据权利要求2所述的一种混合诱变蜡状芽孢杆菌产磷脂酶C的方法，其特征在于步骤二中选取培养基口11为7.0、8.0、9.0。5.根据权利要求2所述的一种混合诱变蜡状芽孢杆菌产磷脂酶C的方法，其特征在于步骤二中选取最佳接种量为I %、2 %、3 %。6.根据权利要求2所述的一种混合诱变蜡状芽孢杆菌产磷脂酶C的方法，其特征在于步骤二中选取最佳装液量为 80mL/250mL、100mL/250mL、120mL/250mL。7.根据权利要求2所述的一种混合诱变蜡状芽孢杆菌产磷脂酶C的方法，其特征在于步骤二中选取摇床转速为140、160、180r/min。8.根据权利要求2所述的一种本文档来自技高网...

【技术保护点】
利用物理、化学诱变蜡状芽孢杆菌产磷脂酶C的方法，其特征在于：以蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)CICC‑21688作为出发菌株，将其单胞子菌悬液依次进行物理和化学诱变，得到一株高产磷脂酶C的菌株，然后确定了该菌株的最适培养条件。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：于殿宇，王立琦，江连洲，潘明喆，齐晓芬，王文华，刘欣，任悦，张青，李中宾，张如春，
申请(专利权)人：东北农业大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23