无机氯化物的应用、杂蛋白絮凝组合物及杂蛋白絮凝方法技术

本发明专利技术涉及蛋白质纯化领域，特别涉及无机氯化物的应用、杂蛋白絮凝组合物及杂蛋白絮凝方法。本发明专利技术提供了无机氯化物在rhCNB工程菌破碎液杂蛋白絮凝中的应用。本发明专利技术在研究rhCNB项目的过程中，发现在适当的加入电解质产生杂蛋白絮凝作用后，较低的保温措施使得杂蛋白颗粒增大的方法，使杂质易于离心去除，保护了目标蛋白，方法经济、高效、可靠、稳定，极大促进和优化了rhCNB的蛋白纯化。杂质清除率≥90％。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及蛋白质纯化领域，特别涉及无机氯化物的应用、杂蛋白絮凝组合物及杂蛋白絮凝方法。
技术介绍
蛋白质是一种具有复杂的空间立体结构的大分子物质，易受外界条件的影响发生变性，有的甚至难以复性。蛋白质稳定性除与蛋白组成中的氨基酸残基种类有关系外，还与去杂、纯化采用的方法有极大的关联，处置不当可能产生蛋白一级结构断裂、高级结构变性和高级级结构裹挟杂质等问题。CNB是钙调蛋白磷酸酶(Calcineurin,CN)B亚基。CN是目前所知唯一一种依赖Ca2+/CaM的蛋白磷酸酶，于上世纪70年代末、80年代初由加籍华人王学荆、美籍华人张槐耀及美国的ClaudeB.Klee分别发现并从牛脑中提纯。该酶由A、B二亚基以1:1的比例组成。A亚基(CNA)是催化亚基，相对分子质量61×103；B亚基(CNB)是调节亚基，相对分子质量19×103。CNB的稳定性较好些，起初曾采用100℃高温去除杂质也能得到纯化物，但由于目标蛋白CNB中含有如谷氨酰胺和天冬酰胺等氨基酸残基易发生水解作用，100℃高温对蛋白的破坏是显而易见的，并且由于高温的作用可能使得有些较大的杂蛋白变成了较小的杂蛋白与目标蛋白混杂裹挟，难以离心去除，妨碍后续纯化。因此，提供一种去除rhCNB工程菌破碎液中杂蛋白的方法及絮凝剂具有重要的现实意义。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供一种无机氯化物的应用、杂蛋白絮凝组合物及杂蛋白絮凝方法。本专利技术在研究rhCNB项目的过程中，发现在适当的加入电解质产生杂蛋白絮凝作用后，较低的保温措施使得杂蛋白颗粒增大的方法，使杂质易于离心去除，保护了目标蛋白，方法经济、高效、可靠、稳定，极大促进和优化了rhCNB的蛋白纯化。杂质清除率≥90％。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了无机氯化物在rhCNB工程菌破碎液杂蛋白絮凝中的应用。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述应用中所述无机氯化物为氯化钠和/或氯化钙。本专利技术还提供了一种杂蛋白絮凝组合物，包括无机氯化物。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述杂蛋白絮凝组合物中所述无机氯化物为氯化钠和/或氯化钙。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述杂蛋白絮凝组合物中所述氯化钠与所述RhCNB工程菌破碎液的质量比为(3～5)：100。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述杂蛋白絮凝组合物中所述氯化钙所述RhCNB工程菌破碎液的质量比为(0.03～0.05)：100。本专利技术还提供了所述杂蛋白絮凝组合物在rhCNB工程菌破碎液杂蛋白絮凝中的应用。本专利技术提供了一种去除rhCNB工程菌破碎液中杂蛋白的方法，包括如下步骤：步骤1：制备获得rhCNB工程菌破碎液；步骤2：取所述rhCNB工程菌破碎液与如权利要求3至6任一项所述的杂蛋白絮凝组合物混合，絮凝，离心分离，收集上清液。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述絮凝的温度为38～58℃。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述絮凝的时间≤45min。本专利技术中，rhCNB工程菌破碎液的制备方法为：取在-70℃冻存的工程菌(基因工程药物与生物技术北京市重点实验室提供原始工程菌，海口奇力制药股份有限公司制备工作种子(生产或制备用rhCNB工程菌)，用LB培养基(每升含蛋白胨10g、酵母粉5g、氯化钠5g、1mol/L氢氧化钠溶液1ml)氨苄青霉素50mg,按每升培养基接种1ml的接种量接种，37℃扩增培养8-18小时，作为一级种子液，再用新配制的LB培养基接种发酵培养10-20小时收取菌体。取菌体，用含有50mmol/L的Tris、1.2mmol/L的依地酸二钠和40mmol/L氯化氢的缓冲溶液pH值为7.4配制成含10：90菌体的菌悬液，用高压匀质机破碎，即得；破碎率达95％以上。本专利技术提供了无机氯化物在rhCNB工程菌破碎液杂蛋白絮凝中的应用。本专利技术在研究rhCNB项目的过程中，发现在适当的加入电解质产生杂蛋白絮凝作用后，较低的保温措施使得杂蛋白颗粒增大的方法，使杂质易于离心去除，保护了目标蛋白，方法经济、高效、可靠、稳定，极大促进和优化了rhCNB的蛋白纯化。在注射用rhCNB药物的制备中，本专利技术找到极其经济、高效的去除杂质的方法，即加两种适量的常见电解质使杂蛋白产生絮凝作用，在较低的温度条件和较短的时间内保证杂蛋白絮凝的完全性、完整性和牢固性，通过较小的相对离心力(RCF)去除大量的杂质满足后续工序的质量要求，降低了杂蛋白絮凝时间和温度，从而降低了目标蛋白被降解的风险，降低了离心机转速，增强了生产操作的安全性。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。图1示实施例2去除杂质后电泳图；其中，泳道M示Marker(南京金斯瑞生物科技M00516，10、20、30、40、60、80、120kD)，泳道1示点样1，泳道2示点样2；图2示实施例3去除杂质后电泳图；其中，泳道M示Marker(南京金斯瑞生物科技M00516，10、20、30、40、60、80、120kD)，泳道1示点样1，泳道2示点样2；图3示实施例4去除杂质后电泳图；其中，泳道M示Marker(南京金斯瑞生物科技M00516，10、20、30、40、60、80、120kD)，泳道1示点样1，泳道2示点样2。具体实施方式本专利技术公开了一种无机氯化物的应用、杂蛋白絮凝组合物及杂蛋白絮凝方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本专利技术。本专利技术的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
技术实现思路
、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本专利技术技术。本专利技术提供的无机氯化物的应用、杂蛋白絮凝组合物及杂蛋白絮凝方法中所用原料及试剂均可由市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本专利技术：实施例1工程菌破碎液的制备本专利技术中，rhCNB工程菌破碎液的制备方法为：取在-70冻存的工程菌(基因工程药物与生物技术北京市重点实验室或市售)，用LB培养基(每升含蛋白胨10g、酵母粉5g、氯化钠5g、1mol/L氢氧化钠溶液1ml)氨苄青霉素50mg,按每升培养基接种1ml的接种量接种，37℃扩增培养8-18小时，作为一级本文档来自技高网...

【技术保护点】
无机氯化物在rhCNB工程菌破碎液杂蛋白絮凝中的应用。

【技术特征摘要】
1.无机氯化物在rhCNB工程菌破碎液杂蛋白絮凝中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述无机氯化物为氯化钠
和/或氯化钙。
3.一种杂蛋白絮凝组合物，其特征在于，包括无机氯化物。
4.根据权利要求3所述的杂蛋白絮凝组合物，其特征在于，所述无机氯
化物为氯化钠和/或氯化钙。
5.根据权利要求3或4所述的杂蛋白絮凝组合物，其特征在于，所述氯
化钠与所述rhCNB工程菌破碎液的质量比为(3～5)：100。
6.根据权利要求3至5任一项所述的杂蛋白絮凝组合物，其特征在于，
所述氯化钙所述rhCNB工程菌破碎液的质量比为...

【专利技术属性】
技术研发人员：李柏，魏群，周湘龙，麦有觉，黄宗文，
申请(专利权)人：海口奇力制药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：海南;66