一种酯酶及其编码基因制造技术

本发明专利技术涉及一种新的酯酶及其编码基因。还涉及包含所述基因的载体以及宿主细胞。本发明专利技术也涉及所述酶的编码基因作为报告基因的用途，以及增强所述酯酶活性的方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种新的酯酶及其编码基因。还涉及包含所述基因的载体以及宿主细胞。
技术介绍
脂类水解酶根据底物链的长短可以分为酯酶和脂肪酶。脂肪酶偏好碳链长度大于10的分子，而且在油-水界面上作用。酯酶(Esterase，EC3.1.1.1，羧基酯水解酶)普遍存在于自然界中，催化水解短链(≤10)酰基酯，广泛应用于医药、食品、洗涤剂、生物能源及油脂工业[BornscheuerUT.Microbialcarboxylesterase：valssification，propertiesandapplicationinbiocatalysis.FEMSMicrobiologyRev2002，26(1)：73-81]。作用于水溶性的底物。广义上包括羧酸酯酶、磷酸单酯酶、磷酸二酯酶、硫酯酶等。裂壶藻是一种重要的异养藻，能够积累高含量的二十二碳六烯酸(DHA)。但相比较细胞内棕榈酸的含量而言，DHA的含量还有较大的提升可能。因此，遗传改造工作需要一种更高活性的启动子来替换现DHA合成系统的启动子，有望提高DHA的合成效率。这就要求一种能够在裂壶藻中能表达、检测方便、可以定量的标记物，来衡量不同启动子的活力。目前已有报道的，在裂壶藻中可以作为报告基因的有荧光(绿色荧光蛋白，GFP基因)和葡萄糖苷酸酶酯酶(GUS基因)。荧光活力检测需要特殊设备，因此GFP以及GUS水解4-甲基伞形酮-beta-D-葡糖苷酸(MUG)都需要荧光检测设备；GUS的另一常用底物5-溴-4氯-3-吲哚葡萄糖苷(X-Gluc)一般用作组织染色定性，难准确定量。因此工业上迫切需要一种能快速、准确检测的报告基因。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种新的酯酶，该酶具有短链脂肪酸酯水解活力以及酯交换的活力。其包含选自以下的序列或由选自以下的序列组成：(a)如SEQIDNO：2所示的氨基酸序列，以及(b)由(a)所述的序列经过取代、缺失或添加至少一个氨基酸后得到的序列，所述取代优选为氨基酸保守性取代，并且所述序列仍然保持SEQIDNO：2的功能。在一个实施方案中，本专利技术的酯酶的序列如SEQIDNO：2所示。此外，本专利技术的SEQIDNO：2还可以具有氨基酸残基的一个或几个缺失、插入或取代，这些改动产生沉默变化或者产生功能上等效的酶。在保持酶活性的情况下，被设计的氨基酸取代可以根据残基在极性、电荷、可溶性、亲水性、疏水性和/或双亲性质上的相似性。例如，带负电的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；具有相似的亲水性的具有不带电的极性头部的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和色氨酸。保守取代可以根据下表来进行。在第二栏中属于同一个分区的氨基酸可以相互取代，在优选的情况下第三栏中同一行的氨基酸可互相取代：本专利技术包括通过对SEQIDNO：2进行删除、插入或保守取代得到的、仍然保留其活性的序列。其应该被视为SEQIDNO：2的等同方案而得到保护。本专利技术还涉及核酸分子，其选自：(1)编码本专利技术的酯酶的核苷酸序列或与(1)所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列。在一个实施方案中，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。技术人员将会认为，由于遗传密码的简并性，多种不同的核苷酸序列可以编码同样的酶。另外，可以认识到，技术人员能够使用常规技术进行不影响本专利技术的核苷酸序列所编码的酶活性的核苷酸取代，这样可以反映表达本专利技术的酶所用的任何特定的宿主生物体的密码子偏倚性。因此，本专利技术也包括与本文列出的SEQIDNO：1和2具有至少90％的同一性，更为优选的情况下具有至少95％的同一性，尤为优选的情况下具有至少98％的同一性，并且仍然保留所需活性的序列。其应该被视为SEQIDNO：1和2的等同方案而得到保护。氨基酸和核酸序列的同一性比较可以采用本领域常规的计算机程序进行。本专利技术还提供了包含所述核酸分子的载体，以及包含所述核酸分子或所述载体的宿主细胞。所述宿主细胞可以是大肠杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母、黑曲霉、米曲霉、破囊壶菌、裂殖壶菌等。在一个实施方案中，所述宿主细胞是细菌细胞。在另一实施方案中，所述细菌细胞是大肠杆菌细胞。本专利技术还涉及本专利技术的核酸分子用作报告基因的用途，优选的，所述报告基因是裂壶藻内指示启动子活力的报告基因。本专利技术的酶从裂壶藻基因组中分离得到，因而能在裂壶藻中良好表达，而且该酶酶活的检测方便、快速，并且能准确定量。因此该酯酶编码基因还可作为裂壶藻中的报告基因。通过构建核酸载体，将待检测的核酸片段安置在载体中该酯酶编码基因前，所构建的载体转入裂壶藻中后，培养重组裂壶藻可通过对硝基苯酚脂肪酸酯为底物，快速、准确地测定本专利技术公开的酯酶酶活，从而判断出载体上，酯酶基因前安置的核酸片段是否能在裂壶藻中表现出启动子活力，以及比较不同核酸片段启动基因表达的强弱。本专利技术还涉及增强本专利技术的酯酶的活性的方法，包括在所述酶的制剂中加入镁离子、钾离子或铵离子，优选的，在酶的制剂中加入氯化钾、氯化钾、硝酸钾、硫酸钾或硫酸铵，最优选的，在酶的制剂中加入硝酸钾。附图说明图1为实施例2中37℃诱导表达物的蛋白电泳图。绝大部分表达蛋白位于细胞沉淀中，为包涵体形式。泳道1：蛋白Marker；泳道2：诱导表达前的菌体蛋白；泳道3：诱导表达后的菌体蛋白；泳道4：诱导表达后菌体裂解液的上清；泳道5：诱导表达后菌体裂解后的沉淀。图2为实施例2中不同结合体系纯化蛋白的电泳结果。泳道1：诱导表达前的菌体蛋白；泳道2：诱导表达后的菌体蛋白；泳道3：发酵液上清；泳道4：蛋白Marker；泳道5：诱导表达后菌体裂解液上清；泳道6：诱导表达后菌体裂解后的沉淀；泳道7：HIS-tag纯化结合步骤中咪唑浓度为1mM的最终洗脱物；泳道8：HIS-tag纯化结合步骤中咪唑浓度为5mM的最终洗脱物；泳道9：HIS-tag纯化结合步骤中咪唑浓度为10mM的最终洗脱物；泳道10：大量菌体裂解液HIS-tag纯化后的洗脱物。图3为实施例3中25℃下表达物裂解上清酶活结果。图4显示本专利技术的重组酯酶对具有不同碳链长度的底物的活性。图4A：Bl21对照。图4B：本专利技术的酯酶图5显示甘油对本专利技术的酯酶活性没有影响。图6显示各种离子存在下本专利技术的酯酶的相对活性。图7显示各种钾离子存在下本专利技术的本文档来自技高网...

【技术保护点】
酯酶，其包含选自以下的序列或由选自以下的序列组成：(a)如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，以及(b)由(a)所述的序列经过取代、缺失或添加至少一个氨基酸后得到的序列，所述取代优选为氨基酸保守性取代，并且所述序列仍然保持SEQ ID NO：2的功能。

【技术特征摘要】
1.酯酶，其包含选自以下的序列或由选自以下的序列组成：
(a)如SEQIDNO：2所示的氨基酸序列，以及
(b)由(a)所述的序列经过取代、缺失或添加至少一个氨基酸后得到的
序列，所述取代优选为氨基酸保守性取代，并且所述序列仍然保持SEQ
IDNO：2的功能。
2.核酸分子，选自：(1)编码权利要求1的酯酶的核苷酸序列或
与(1)所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
3.权利要求2的核酸分子，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。
4.载体，其包含权利要求2或3的核酸分子...

【专利技术属性】
技术研发人员：戴小军，许骏，
申请(专利权)人：丰益上海生物技术研发中心有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31