本发明专利技术提供一种耐久肠球菌素突变体、编码基因及其应用，涉及食品领域。耐久肠球菌素突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。本发明专利技术还要求保护耐久肠球菌素突变体的编码基因和应用。本发明专利技术耐久肠球菌素突变体具有较广抑菌谱、较高活性和稳定性，制备方法简单，有望应用于食品级防腐剂领域。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及食品领域，具体涉及。
技术介绍
乳酸菌细菌素是一类乳酸菌代谢过程中由核糖体合成并分泌到环境中具有抑 菌活性的蛋白质或多肽，在食品保藏中极具重要意义。自乳酸链球菌素Nisin商业应用 以来，细菌素的研究开发一直是相关领域的热点。耐久肠球菌素Durancin GL(GenBank: HQ696461. 1)是从西班牙干酪中分离的耐久肠球菌41D株所产生的新型细菌素，尤其 对李斯特菌等食源性人体致病菌具有祀向抑制作用（Du, Lihui，Somkuti, GeorgeA.， Renye，JohnA.，Jr.，Huo, Guicheng. Journal of Food Safety, 2012, 32 (1) : 74-83.)。但是， 耐久肠球菌素Durancin GL活性较低、抑菌谱较窄。耐久肠球菌素Durancin GL的生物合 成基因（GenBank登录号HQ696461. 1)包括结构基因（durA)和免疫基因（durB)，其中结构 基因编码耐久肠球菌素Durancin GL前体，免疫基因编码耐久肠球菌素Durancin GL的免 疫蛋白以防止表达的细菌素对宿主的伤害。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供具有较广抑菌谱、较高活性的耐久肠球菌素突变体。 本专利技术的另一目的在于提供耐久肠球菌素小肽突变体的编码基因。 本专利技术的再一目的在于提供耐久肠球菌素小肽突变体在食品级防腐剂中的应用。 本专利技术的目的采用如下技术方案实现： 耐久肠球菌素突变体，其氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。 本专利技术还要求保护所述耐久肠球菌素突变体的编码基因。 优选的技术方案中，所述编码基因的序列如SEQ ID N0:3所示。 本专利技术还要求保护含有所述编码基因的表达盒、重组载体、重组菌或细胞系。 本专利技术还要求保护所述耐久肠球菌素小肽突变体在制备食品级防腐剂方面的应 用。 本专利技术耐久肠球菌素突变体具有较广抑菌谱、较高活性和稳定性，制备方法简单， 有望应用于食品级防腐剂领域。【附图说明】 图1突变质粒的PCR鉴定电泳结果，M为DS 5000 DNA Marker，l为突变质粒的PCR 产物。 图 2 DE3-pGEX-durAB-K12A 的 PCR 鉴定电泳分析，M 为 DS 5000 DNA Marker，1 为 DE3-pGEX-durAB-K12A 的 PCR 产物。 图3突变体K12A抑菌活性，其中1是耐久肠球菌素Durancin GL抑菌圈，2为耐久 肠球菌素突变体K12A抑菌圈。 图4突变体K12A的稳定性。【具体实施方式】 以下通过实施例对本专利技术作进一步阐述。 实施例1 耐久肠球菌素Durancin GL成熟肽的氨基酸序列如SEQ ID N0:1所示。耐久肠球 菌素Durancin GL的前体带有信号肽，其编码基因如SEQ ID N0:4所示。本实施例描述将 SEQ ID N0:1中第12位的氨基酸K (赖氨酸）采用A (丙氨酸）取代制备耐久肠球菌素突变 体（命名为K12A)的具体方法。耐久肠球菌素突变体K12A的氨基酸序列如SEQ ID N0:2， 编码基因的序列如SEQ ID N0:3所示。 1?扩增细菌素融合基因片段 为了便于纯化和表达，设计引物扩增制备由His标签、肠激酶酶切位点、耐久肠球 菌素Durancin GL的成熟肽编码基因（SEQ ID N0:4去除信号肽编码序列后的第85-216位 核苷酸片段）和免疫基因（durB，GenBank登录号HQ696461. 1)组成的细菌素融合基因片 段。 针对耐久肠球菌素Durancin GL的成熟肽编码基因和免疫基因，设计引物 durl(SEQ ID N0:5)和dur2(SEQ ID N0:6)，其中引物durl带有His标签和肠激酶酶切位 点。 其中，durl 的序列为：5'-GTGGGATCCC ACCATCATCA TCATCATGAC GACGACGACA AGGCAACTTA TTATGGAAAT GGTGTTTATT G-3' ， dur2 的序列为：5'-AAACTCGAGT TTAACTCCAA ATACCGATAG ACGCCCATCC CC-3'。 以耐久肠球菌41D株新鲜过夜培养菌液为模板，以durl和dur2为引物，扩增含 有耐久肠球菌素Durancin GL的成熟肽编码基因和免疫基因的细菌素融合基因片段。将 2. Oyl耐久肠球菌41D株过夜培养的菌液与25. Oyl HS? Mix(购自TaKaRa)、1.0yl durl、1.0iildur2 和21.0iil ddH20 混合后，在 PCR 仪（Applied Biosystems)中按照下列 程序进行反应：升温至95°C维持30s ;95°C变性15s，62°C退火20s，72°C延伸60S，反应30 个循环；降温至72°C维持7min。 2.构建携带细菌素融合基因片段的重组载体 采用多功能DNA纯化回收试剂盒（北京百泰克生物技术有限公司）将细菌素融合 基因片段回收，然后与pEASY-Blunt Simple Cloning Vector(购自北京全式金生物技术有 限公司）按照插入片段与线性载体物质的量之比约为7:1混匀，置于25°C下反应约lOmin， 获得重组质粒pEASY/durAB。 将重组质粒 pEASY/durAB 转化到 Transl-Tl Competent E. coli (Transl-Tl 感受 态E.coli，购自北京全式金生物技术有限公司）细胞中，大量培养后提取重组质粒进行序 列鉴定。从序列鉴定正确的菌株中扩增细菌素融合基因片段，并经BamH I和Xho I双酶 切，回收酶切片段。采用BamH I和Xho I双酶切pGEX-6P-l质粒（Invitrogen)，回收载体 片段。将细菌素融合基因片段和载体的双酶切片段进行连接，构建重组质粒pGEX-durAB。 3.构建表达耐久肠球菌素突变体的重组菌 设计突变引物 K12A-F(SEQ ID N0:7)和 K12A-R(SEQ ID N0:8)，具体序列如下： K12A-F:5r -AATGCACAAGAATGTTGGGTAGATTGGAATAAAGCTTC-3r , K12A-R:5' -TACCCAACATTCTTGTGCATTACAATAAACACCATTTCCA-3'。 以重组质粒pGEX-durAB为模板，以K12A-当前第1页1 2 本文档来自技高网...
【技术保护点】
耐久肠球菌素突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：鞠兴荣，都立辉，陈信全，吴学友，袁建，何荣，和肖营，刘凌平，
申请(专利权)人：南京财经大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。