基于高通量基因测序无创检测线粒体DNA的方法技术

本发明专利技术提供了一种基于高通量基因测序无创检测线粒体DNA的方法，该方法步骤如下：（1）提取口腔细胞总基因组DNA；（2）设计PCR引物及体外富积扩增线粒体DNA：（3）高通量测序检测。本发明专利技术的方法实验设计严谨、实验流程简单，检测结果准确、快速、自动化程度高，可以不同程度满足科研及临床检测的需求，适用于科研和临床针对线粒体相关的突变快速检测。

【技术实现步骤摘要】
基于高通量基因测序无创检测线粒体DNA的方法
本专利技术属于基因工程领域，具体涉及一种无创检测线粒体DNA序列的方法。
技术介绍
人类的线粒体DNA全基因组(mitochondrial DNA, mtDNA)为全长16569bp的闭合双链环状分子，线粒体DNA基因组的NCBI登陆号为NC_012920，全基因组编码区共37个基因，这37个基因中有22个编码转移核糖核酸(tRNA)、2个编码核糖体核糖核酸(12S和16SrRNA)，13个编码多肽。mtDNA基因排列紧密，序列间没有发现内含子。mtDNA有独特的母系遗传特性，一般认为mtDNA随母本的卵细胞传递给后代；mtDNA在细胞中的拷贝数很高，一个细胞中往往含有高达数千个mtDNA拷贝，mtDNA具有较高的突变率，大量研究显示mtDNA突变频率较核基因组高10倍以上，突变的mtDNA与野生型的mtDNA可以同时存在一个细胞内发挥不同的生物学功能能，多数mtDNA突变都为有害突变，mtDNA突变导致的临床表型极为广泛，几乎涉及到所有的组织和器官，mtDNA突变带来的危害存在剂量效应，轻微的突变并不出现典型的临床症状，给临床诊断带来了极大的困难，很多线粒体疾病无法得到确诊，故线粒体基因组的准确检测具有重要的临床指导意义。传统的线粒体基因检测方法主要包括:PCR-RFLP、AS_PCR和DNA —代测序、芯片方法等，这些方法在基因突变检测中起了重要作用，但普遍存在着明显的不足，临床上常针对mtDNA的检测，还仅集中在对少数常见的线粒体基因位点进行突变和缺失筛查，如对线粒体相关性糖尿病常见突变A3243 G的筛查，阳性检出率低，大多数患者难以获得准确的病因诊断；另外线粒体病具有量效现象，即小量的线粒体DNA突变可能不出现临床症状，随着突变线粒体比例增高，出现临床表现，且临床严重程度可能和突变比例成正相关，目前常用的检测方法对于低剂量的线粒体突变都不能很好的检测，如果用传统的方法检测会出现很多漏检的现象；另外传统的检测方法检测基因位点有限、耗时长、操作繁琐等，不适用于大批量、系统检测，结果假阳性高，结果不能自动化分析，给线粒体疾病的临床诊断带来困难。
技术实现思路
本专利技术目的是针对以上要解决的技术问题，提供一种准确、快速、检测流程简单的检测线粒体DNA序列的方法。为此，本专利技术公开了一种基于高通量基因测序无创检测线粒体DNA的方法，该方法步骤如下:(I)提取口腔细胞总基因组DNA ;(2)设计PCR引物及体外富积扩增线粒体DNA:设计两对PCR扩增引物，对抽提出来的总基因组DNA进行完整的线粒体DNA体外富积扩增；扩增产物的长度分别为9391bps和7287bps，此时扩增产物能够覆盖整条完整的mtDNA序列；第一对PCR引物序列为:F70655’-GCCATCATAGGAGGCTTCATTCAC-3’ ，R164555’-CGGAGCGAGGAGAGTAGCACTCTT-3’ ，扩增线粒体DNA的位点7065/16455区域，扩增产物长度为9391bps ；第二对PCR引物序列为:F163945’-CCTTGACCACCATCCTCCGTGAA-3’ ，R71I15，-TAGCCTGAGAATAGGGGAAATCAGT-3，扩增线粒体DNA的位点16394/7111，扩增产物长度为7287bps。(3)使用1n Torrent个人化操作基因组测序仪进行高通量测序检测。根据本专利技术的方法，所述步骤(2)中，用上述引物配合如下反应体系:PCR为50iU总体系，具体是 5XPhusion HF BufferlOu 1,2.5mM dNTPmix5 y 1，IOmM 的上下游引物各2u l,2U/u I的Phusion DNA聚合酶0.8 iil，1-1Ong的总基因组DNA模板I iil，用灭菌水补足50iU体系，反应条件为“降落PCR”:95°C 5min预变性，循环内98°C IOs变性，从68°C每个循环降1°C退火，72°C延伸5min，10个循环；在62°C退火，进行25个循环；PCR反应循环后72°C继续延伸7min，然后16°C保存。根据本专利技术的方法，所述步骤(3)的具体操作步骤如下:3.1割胶回 收纯化线粒体DNA片段及回收效果检测:纯化产物，回收片段，分别取出Iul线粒体扩增片段PCR后产物，利用QB2.0HS DNA荧光检测试剂进行浓度检测；根据样品检测出的浓度，决定用于下步实验的DNA起始总量；根据PCRl和PCR2的长度，确定取PCRl的量，保证PCR产物的分子个数接近同比例，然后混匀，补水，建库；3.2DNA超声波打断:将线粒体基因组打断15个cycles，打断结果为150_400bp范围内；3.3末端修复和纯化DNA:按起始量加入无核酸酶水到打断后DNA中，在1.5mlLoBindTube中混匀，室温下孵育20min ；3.4连接接头、缺口补平和纯化连接的DNA:用the Agencourt? AMPure? XP Kit纯化末端修复产物；3.5片段选择:取IOul连接纯化后的线粒体DNA样品，进行1.8%琼脂糖凝胶电泳，120v，90min ;电泳结果:线粒体连接后非扩增文库大小在200_600bp范围内有连续条带，根据接头、barcode和目的片段文库大小，进行切胶300_350bp处条带利用ThermoScientific GeneJET Gel Extraction Kit 进行回收；3.6扩增及纯化DNA ；3.7文库质控:检测文库片段大小、文库浓度，并确定文库稀释因子；3.8上机测序及测序结果分析:将制备好的文库在Life technologies公司的1nPGM sequencer高通量测序仪上进行测序,读长250BP，要求测序深度达到3000 X，每个样本产生约90M的数据量；测序数据经过信息分析得到线粒体全基因组序列资料，与线粒体参考序列比对，即可获得样本线粒体序列变异信息，包括点突变、缺失、插入等变异情况。。本专利技术提供的基于高通量基因测序无创检测线粒体DNA的方法，涉及分子生物学和生物信息学，本方法只设计两对灵敏的引物，配合优化的PCR反应条件无需单独分离细胞线粒体DNA，只需要细胞总DNA为模板就可以实现体外线粒体DNA的富积扩增，可以做到无创标本(口腔黏膜细胞样品)的检测。技术中的扩增引物配合优化的PCR反应体系和条件，完全可以应用于线粒体DNA全基因组的检测。该方法实验设计严谨、实验流程简单，检测结果准确、快速、自动化程度高，可以不同程度满足科研及临床检测的需求，适用于科研和临床针对线粒体相关的突变快速检测，有助于临床疾病的正确诊断和分类，早发现病人，早预防，早治疗。此外，本方法配合使用Life technologies公司的1n Torrent个人化操作基因组测序仪(PGM?)，它是市场上相较其他测序技术，更简单，经济和具有强大的可扩展性的测序平台。PGM?台式系统的设计配合革新性的半导体芯片技术，使整个平台具有极高的扩展性和快速完成测序的性能。1n Torrent技术通过专有的大规模并行半导体感应器，对于DNA复制时产生的离子流,实现直接和实时的检测。当试剂通过集成的流体通路进入1nTorr本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于高通量基因测序无创检测线粒体DNA的方法，该方法步骤如下：?（1）提取口腔细胞总基因组DNA；?（2）设计PCR引物及体外富积扩增线粒体DNA：设计两对PCR扩增引物，对抽提出来的总基因组DNA进行完整的线粒体DNA体外富积扩增；扩增产物的长度分别为9391bps和7287bps，此时扩增产物能够覆盖整条完整的mtDNA序列；?第一对PCR引物序列为：?F70655“?GCCATCATAGGAGGCTTCATTCAC?3“，?R164555“?CGGAGCGAGGAGAGTAGCACTCTT?3“，?扩增线粒体DNA的位点7065/16455区域，扩增产物长度为9391bps；?第二对PCR引物序列为：?F163945“?CCTTGACCACCATCCTCCGTGAA?3“，?R71115“?TAGCCTGAGAATAGGGGAAATCAGT?3“?扩增线粒体DNA的位点16394/7111，扩增产物长度为7287bps；?（3）使用Ion?Torrent个人化操作基因组测序仪进行高通量测序检测。

【技术特征摘要】
1.一种基于高通量基因测序无创检测线粒体DNA的方法，该方法步骤如下: (1)提取口腔细胞总基因组DNA； (2)设计PCR引物及体外富积扩增线粒体DNA:设计两对PCR扩增引物，对抽提出来的总基因组DNA进行完整的线粒体DNA体外富积扩增；扩增产物的长度分别为9391bps和7287bps，此时扩增产物能够覆盖整条完整的mtDNA序列； 第一对PCR引物序列为:F70655’-GCCATCATAGGAGGCTTCATTCAC-3’ ，R164555’-CGGAGCGAGGAGAGTAGCACTCTT-3’ ， 扩增线粒体DNA的位点7065/16455区域，扩增产物长度为9391bps ； 第二对PCR引物序列为:F163945’-CCTTGACCACCATCCTCCGTGAA-3’ ，R7III5，-TAGCCTGAGAATAGGGGAAATCAGT-3， 扩增线粒体DNA的位点16394/7111，扩增产物长度为7287bps ； (3)使用1nTorrent个人化操作基因组测序仪进行高通量测序检测。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述步骤(2)中，用上述引物配合如下反应体系:PCR 为 50ii I 总体系，具体是 5XPhusion HF BufferlOu 1,2.5mM dNTPmix5 u I,IOmM的上下游引物各2iil，2U/iil的Phusion DNA聚合酶0.8 yl，1-1Ong的总基因组DNA模板Iu 1，用灭菌水补足50 ill体系，反应条件为“降落PCR”:95°C 5min预变性，循环内980C IOs变性，从68°C每个循环降1°C退火，72°C延伸5min，10个循环；在621:退火，进行25个循环；PCR反应循环后72°C继续延伸7min，然后16°C保存。3.根据权利要求1所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：张茂雷，陈杰，郭玲玲，何东海，
申请(专利权)人：广州赛哲生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：