本发明专利技术公开了一种能持续、稳定分泌抗口蹄疫A型(Re‑A/WH/09)病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株7E3，并由该细胞株分泌得到单克隆抗体7E3anti及其应用。本发明专利技术的单克隆抗体能够特异性地识别口蹄疫A型(Re‑A/WH/09)病毒，可用于双抗体夹心法检测口蹄疫A型(Re‑A/WH/09)病毒抗原浓度；或者用于竞争法检测口蹄疫A型病毒抗体水平，灵敏度高、特异性好，可用于疫苗生产、产品质检中对口蹄疫A型(Re‑A/WH/09)病毒抗原的检测或口蹄疫A型(Re‑A/WH/09)病毒疫苗免疫后抗体水平的评价。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
中的杂交瘤细胞株及其分泌的单克隆抗体与应用，特别是涉及口蹄疫A型(Re-A/WH/09)病毒的单克隆抗体和分泌该抗体的杂交瘤细胞株以及该抗体在检测口蹄疫A型(Re-A/WH/09)病毒中的应用。
技术介绍
口蹄疫是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus，FMDV)感染引起的偶蹄动物共患的传染病。FMDV目前有O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3(即南非口蹄疫病毒1、2、3型)和Asia1(亚洲1型)七个血清型。各型之间几乎没有免疫保护力，感染了一型口蹄疫的动物仍可感染另一型口蹄疫病毒而发病。近十几年以来，全世界口蹄疫的流行态势发生了一些新的变化。一方面未消灭口蹄疫的国家和地区，口蹄疫继续流行，而另一方面已控制和消灭口蹄疫的国家和地区，也出现口蹄疫的发生和流行。从FAO/OIE口蹄疫参考实验室报告的资料来看，在1990-2002年之间，口蹄疫在世界范围内的流行还是非常严重的，七个型的口蹄疫均有流行，其中以O、A和Asia1型的流行较为严重。FMDV属于微核糖核酸病毒科(picornaviridae)口蹄疫病毒属(aphthavirus)的成员。感染FMDV的细胞培养液，在电镜下观察有四种粒子。第一种，即最大粒子为完整病毒，直径23±2nm，沉降系数为146S，具有感染性，呈圆形或六角形，正二十面体对称，分子量6.9×106Da，无囊膜，在氯化艳中的浮密度为1.43g/mL，病毒由中央的核糖核酸核芯和周围的蛋白壳体所组成，成熟病毒粒子约含30％的RNA，其余70％为蛋白质。第二种为不含有RNA的空衣壳，直径21nm，沉降系数为75S，没有感染性，有型特异性和免疫原性。第三种为衣壳蛋白亚单位，其直径为7nm，沉降系数为12S-14S，无RNA，无感染性，有抗原性。第四种为病毒感染相关抗原(Virus infection-associated antigen，VIA抗原)，沉降系数为4.5S，为病毒的非结构蛋白(病毒RNA聚合酶)，能诱发动物产生群特异抗体，无型特异性，在琼脂扩散试验中对各型口蹄疫病毒的抗体都呈现反应，可以应用VIA抗原检测各型口蹄疫病毒感染动物的血清抗体。Re-A/WH/09病毒是口蹄疫A型的一个毒株，该毒株是由中国农业科学院兰州兽医研究所在A/WH/CHA/09毒株基础上通过反向遗传构建技术制备而来的，在BHK21细胞
上遗传稳定，免疫原性好，疫苗的交叉保护性高，每毫升抗原表达量可达2μg以上，每毫升TCID50可达107.5以上。疫苗接种是目前特异性预防FMDV的可靠和有效手段。疫苗企业为提高疫苗的免疫保护作用，往往会把口蹄疫病毒多种血清型病毒毒株混合制成多价疫苗，比如金宇保灵生物药品有限公司生产的口蹄疫O、A、亚1三价疫苗，该疫苗中含有口蹄疫O型毒株(O/Mya98/XJ/2010)、口蹄疫A型毒株(Re-A/WH/09)和口蹄疫亚洲1型毒株(JSL/06)。疫苗中病毒含量的准确控制及免疫后抗体水平的有效监测是成功免疫的保障。蔗糖密度梯度离心法是目前疫苗生产过程中对FMDV病毒浓度常用的定量方法，但是，该方法操作复杂，需时较长，一般3天左右，并且只能根据沉降系数对蛋白进行定量，同样沉降系数的蛋白或病毒无法区分，因此口蹄疫多价疫苗中每种毒株的含量无法单独测量。PCR方法(专利公开号CN104195268A、CN104212916A)是一个高灵敏的方法，但是对实验环境和人员的要求较高，且不用于疫苗生产过程中的定量检测。中国农业科学院兰州兽医研究所公布了一种采用多克隆抗体定量检测口蹄疫A型病毒的ELISA方法(公开号CN103091490A)。ELISA方法对实验环境和操作人员的要求较为简单，一般只需要一台酶标仪和水浴锅即可。中国农业科学院兰州兽医研究所公布的试剂盒采用了口蹄疫A型的兔抗血清和豚鼠抗血清两种多克隆抗体制成。虽然专利申请说明书中显示该方法具有较好的特异性，能够区分O型和亚洲1型，但是由于多克隆抗体往往针对多个抗原位点，且多克隆抗体生产时批间变异较大，因此，如采用特异性和重复性更好的单克隆抗体，效果可能会更佳。研制基于高灵敏度、高特异性的抗Re-A/WH/09毒株的单克隆抗体的ELISA检测试剂，不仅可用于疫苗生产过程中抗原的定量，也可用于口蹄疫多价疫苗中Re-A/WH/09病毒毒株的单独含量检测，且不受多价疫苗中口蹄疫其它毒株的干扰，这正是本专利技术所期望并能够达到的。偶蹄动物免疫口蹄疫疫苗后，常通过检测口蹄疫抗体水平来评价疫苗的保护效果。对口蹄疫抗体水平的检测常采用竞争ELISA法或液相阻断ELISA法，市场上常见的产品有中国农业科学院兰州兽医研究所的液相阻断ELISA试剂盒和韩国进口竞争法ELISA试剂盒。广西壮族自治区动物疫病预防控制中心中公布了一种基于口蹄疫A型病毒VP1蛋白及其单抗的竞争ELISA方法(专利文献公开号CN103554234A)，该方法采用了单克隆抗体，与液相阻断ELISA检测试剂盒比，符合率为95.8％，暂时不能从公开的信息确定抗体的特异性状况。胶体金免疫纸层析是一种基于抗原抗体的快速检测方法，可以在10-20分钟内完成检测，不需要大型的仪器设备，非常适合于现场检测，它可通过目测进行定性检测，也可配套小型的仪器实现定量检测。如能以单克隆
抗体实现胶体金竞争法快速测量疫苗免疫后抗体的水平，在现场、野外或小规模的养殖场将会有很大的用途和意义。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供一种分泌口蹄疫A型(Re-A/WH/09)病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其产生的单克隆抗体。本专利技术以口蹄疫A型(Re-A/WH/09)病毒为免疫原免疫小鼠，获得持续、稳定分泌抗口蹄疫A型(Re-A/WH/09)病毒的特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株，名称为7E3，该细胞株已于2016年6月24日保藏于位于中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国普通微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.12674。由杂交瘤细胞株7E3分泌的单克隆抗体命名为7E3anti，来源于小鼠属小鼠(Mus musculus)，也属于本专利技术的保护范围。7E3anti的重链可变区具有序列表中的SEQ ID No：1的氨基酸残基序列或将序列表中SEQ ID No：1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且可与口蹄疫A型(Re-A/WH/09)病毒特异结合的多肽；轻链可变区具有序列表中的SEQ ID No：2的氨基酸残基序列或将序列表中SEQ ID No：2的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且可与口蹄疫A型(Re-A/WH/09)病毒特异结合的多肽。序列表中的SEQ ID No：1由134个氨基酸残基组成，序列表中的SEQ ID No：2由105个氨基酸残基组成。编码单克隆抗体7E3anti的基因(7E3anti)，其重链可变区编码基因具有序列表中SEQ ID No：3的DNA序列或编码序列表中SEQ ID No：1的DNA序列或在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID No：3限定的DNA序列杂交的核苷本文档来自技高网...
【技术保护点】
杂交瘤细胞株7E3，保藏编号为CGMCC No.12674，是以口蹄疫A型(Re‑A/WH/09)病毒为免疫原免疫小鼠获得的持续、稳定分泌抗口蹄疫A型(Re‑A/WH/09)病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞。
【技术特征摘要】
1.杂交瘤细胞株7E3，保藏编号为CGMCC No.12674，是以口蹄疫A型(Re-A/WH/09)病毒为免疫原免疫小鼠获得的持续、稳定分泌抗口蹄疫A型(Re-A/WH/09)病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞。2.由权利要求1所述的杂交瘤细胞株7E3CGMCC No.12674分泌的单克隆抗体7E3anti。3.根据权利要求2所述的单克隆抗体7E3anti，其特征在于：所述单克隆抗体7E3anti的重链可变区具有序列表中的SEQ ID No：1的氨基酸残基序列或将序列表中SEQ ID No：1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且可与口蹄疫A型(Re-A/WH/09)病毒特异结合的多肽，轻链可变区具有序列表中的SEQ ID No：2的氨基酸残基序列或将序列表中SEQ ID No：2的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且可与口蹄疫A型(Re-A/WH/09)病毒特异结合的多肽。4.编码权利要求2或3所述单克隆抗体7E3anti的基因(7E3anti)，其重链可变区编码基因具有序列表中SEQ ID No：3的DNA序列或编码序列表中SEQ ID No：1的DNA序列或在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID No：3限定的DNA序列杂交的核苷酸序列，其轻链可变区编码基因具有序列表中SEQ ID No：4的DNA序列或编码序列表中SEQ ID No：2的DNA序列或在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID No：4限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。5.一种检测口蹄疫A型(Re-A/WH/09)病毒抗原的ELISA试剂盒，包括用7E3anti作为包被抗体包被的微孔板和用7E3anti作为酶标抗体的酶标记抗体工作液。6.根据权利要求5所述检测口蹄疫A型(Re-A/WH/09)病毒抗原的ELISA试剂盒，其特征在于：所述用7E3anti作为包被抗体包被的微孔板指的是用10mM pH7.2-7.6PBS将7E3anti稀释成0.5-10μg/mL，加入微孔板中，100μl/孔，置于2-8℃过夜；拍干后，加入含0.5％酪蛋白的10mM pH7.2-7.6PBS，300μl/孔，置于2-8℃过夜；拍干、干燥后真空装入铝箔袋中备用...
【专利技术属性】
技术研发人员：郑金来，吴园园，
申请(专利权)人：北京三联博悦生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。