DC细胞的培养方法、TLR激动剂及其应用技术

本发明专利技术公开了一种DC细胞的培养方法、TLR激动剂及其应用，其中，所述TLR激动剂包括：多聚T寡脱氧核苷酸、咪唑喹啉衍生物和溶剂；其中，所述多聚T寡脱氧核苷酸的浓度为1～90μmol/L；所述咪唑喹啉衍生物的浓度为0.1～900μg/ml，且结构式如下：本发明专利技术TLR激动剂可以促进DC细胞的快速成熟，且强化DC细胞的抗原呈递能力。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及免疫细胞
，尤其涉及一种DC细胞的培养方法、TLR激动剂及其应用。
技术介绍
TLR(Toll-like Receptors，Toll样受体)是参与非特异性免疫的一类重要蛋白质分子，也是连接非特异性免疫和特异性免疫的桥梁。TLR是单个的跨膜非催化性蛋白质，可以识别来源于微生物的具有保守结构的分子。当微生物突破机体的物理屏障，如皮肤、粘膜等时，TLR可以识别它们并激活机体产生免疫细胞应答。具体地，TLR是Ⅰ型跨膜受体，由胞质Toll-IL-1受体结构域(Toll-IL-1receptor domain，TIR结构域)、跨膜结构域和胞外结构域组成。TIR结构域提供了一个关键点，能和MyD88(髓样分化因子88)家族中的包含TIR结构域的连接蛋白产生同型交互作用进而启动两条主要的信号通路下传到TLRs：一条是介导的途径导致促炎细胞因子的产生；另一条是IRF(干扰素调节因子)介导的途径导致干扰素的产生。TLR胞外域的特点是含19～26个拷贝的富含亮氨酸的重复序列(LLRs)，每个LLRs含24个氨基酸残基，进而TLR胞外域可以通过LLRs识别配体。在所有TLRs中，TLR7和TLR8在种系发生上彼此接近并且具有高度的序列同源性，因此它们的配体识别有重叠区。迄今为止，多种配体被鉴定为TLR7和/或TLR8配体(即TLR7/8激动剂)，这些配体按其来源分为合成化合物和天然核苷类化合物。树突细胞(Dendritic Cells，DC细胞)是近年来倍受人们关注的专职抗原呈递细胞(Antigen Presenting Cells，APC)，能摄取、加工及呈递抗原，启动T细胞介导的免疫反应。DC细胞的生物学功能包括：抗原提呈和免疫调节。具体地，DC细胞可表达TLR，借助TLR识别LPS(脂多糖)、GpG-DNA、肽聚糖、脂蛋白以及分支杆菌的细胞壁成分等具有PAMP(pathogen-associated molecular patterns，病原体相关分子模式)的分子，DC细胞通过TLR作为桥
梁而被微生物成分引起活化而成熟，提供获得性免疫的共刺激信号，进而可以诱导抗微生物防御系统，产生IL-1β、IL-6和TNF以及趋化型细胞因子，从而调节机体Th1和Th2两种方面的平衡。业已发现，一旦某些TLR被刺激，可以促进DC细胞成熟，细胞粘附分子和趋化因子受体表达发生改变，上调细胞表面MHC分子、粘附分子及共刺激分子如CD40、CD54、CD80、CD83、CD86的表达，分泌促炎细胞因子IL-1、IL-6、IL-12、IL-18和IL-23。因此，TLR能诱导DC成熟和细胞因子分泌，从而调节抗原呈递、T细胞的极化，影响和控制天然和适应性免疫应答的强度及质量。鉴于DC细胞在免疫反应中的重要作用，通常采用体外培养的方法对DC细胞进行扩增。目前，DC细胞的扩增方案很多，如采用组合细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α、PGE-2等或者联合聚肌胞苷酸、细菌脂多糖等促进DC细胞成熟，然而上述促DC成熟剂仅能缓慢地促进DC细胞成熟，且低水平分泌促炎细胞因子，抗原呈递能力弱。
技术实现思路
本专利技术的主要目的在于提供一种TLR激动剂，旨在促进DC细胞的快速成熟以及强化DC细胞的抗原呈递能力。为实现上述目的，本专利技术提供一种TLR激动剂，所述TLR激动剂包括：多聚T寡脱氧核苷酸、咪唑喹啉衍生物和溶剂；其中，所述多聚T寡脱氧核苷酸的浓度为1～90μmol/L；所述咪唑喹啉衍生物的浓度为0.1～900μg/ml，且结构式如下：优选地，所述咪唑喹啉衍生物的浓度为500μg/ml。优选地，所述多聚T寡脱氧核苷酸的浓度为50μmol/L。此外，为实现上述目的，本专利技术还提供一种DC细胞的培养方法，所述培养方法包括步骤如下：获取未成熟DC细胞，将所述未成熟DC细胞置于培养基中；再向所述培养基中加入TLR激动剂进行培养至所述未成熟DC细胞成熟；其中，所述TLR激动剂包括多聚T寡脱氧核苷酸和咪唑喹啉衍生物，所述咪唑喹啉衍生物在所述培养基中的终浓度为0.1～0.9μg/ml且所述多聚T寡脱氧核苷酸在所述培养基中的终浓度为1～4μmol/L。优选地，所述咪唑喹啉衍生物的终浓度为0.5μg/ml。优选地，所述多聚T寡脱氧核苷酸的终浓度为2.5μmol/L。优选地，所述DC细胞的培养时间为6～48h。优选地，所述培养基为含巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素4的无血清培养基。优选地，所述DC细胞为人树突状细胞。此外，为实现上述目的，本专利技术还提供一种如上所述的TLR激动剂在免疫佐剂的应用。本专利技术技术方案，通过将咪唑喹啉衍生物与多聚T寡脱氧核苷酸共混而可以起到协同刺激DC细胞上的TLR7/8的作用，引起DC细胞表达TLR8，进而TLR8诱导了DC细胞的活化而促进DC细胞的快速成熟；而且DC细胞大量表达TNF-α、IL-12，即TLR8同时强化了DC细胞的抗原呈递能力。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的内容获得其他的附图。图1A为本专利技术实施例1培养24h后在倒置相差显微镜下的形态示意图；图1B为本专利技术对比例1培养24h后在倒置相差显微镜下的形态示意图；图1C为本专利技术对比例2培养24h后在倒置相差显微镜下的形态示意图；图1D为本专利技术对比例3培养24h后在倒置相差显微镜下的形态示意图；图2A为RT-PCR检测实施例1培养的DC细胞TLR8表达的示意图；图2B为Western blot检测实施例1培养的DC细胞TLR8蛋白表达的示意图；图2C为免疫荧光法检测实施例1培养的DC细胞TLR8表达的示意图；图2D为激光共聚焦检测实施例1培养的DC细胞TLR8的分布的示意图；图3A为ELISA检测DC细胞在培养12h和24h TNF-α蛋白表达的示意图；图3B为ELISA检测DC细胞在培养12h和24h IL-12蛋白表达的示意图；图3C为ELISA检测DC细胞在培养12h和24h IL-10蛋白表达的示意图。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。本专利技术提供一种TLR激动剂，该TLR激动剂包括：多聚T寡脱氧核苷酸、咪唑喹啉衍生物和溶剂；其中，该多聚T寡脱氧核苷酸的浓度为1～90μmol/L；该咪唑喹啉衍生物的浓度为0.1～900μg/ml，且化学结构式如下：本专利技术TLR激动剂作为TLR的配体，将咪唑喹啉衍生物与多聚T寡脱氧核苷酸共混而可以起到协同刺激DC细胞上的TLR7/8的作用，引起DC细胞表达TLR8，进而TLR8诱导了DC细胞的活化而促进DC细胞的快速成熟；而且DC细胞大量表达TNF-α、IL-12，即TLR8同时可以强化DC细胞的抗原呈递能力；因此，该TLR激动剂有效提高本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种TLR激动剂，其特征在于，包括：多聚T寡脱氧核苷酸、咪唑喹啉衍生物和溶剂；其中，所述多聚T寡脱氧核苷酸的浓度为1～90μmol/L；所述咪唑喹啉衍生物的浓度为0.1～900μg/ml，且结构式如下：

【技术特征摘要】
1.一种TLR激动剂，其特征在于，包括：多聚T寡脱氧核苷酸、咪唑喹啉衍生物和溶剂；其中，所述多聚T寡脱氧核苷酸的浓度为1～90μmol/L；所述咪唑喹啉衍生物的浓度为0.1～900μg/ml，且结构式如下：2.如权利要求1所述的TLR激动剂，其特征在于，所述咪唑喹啉衍生物的浓度为500μg/ml。3.如权利要求1或2所述的TLR激动剂，其特征在于，所述多聚T寡脱氧核苷酸的浓度为50μmol/L。4.一种DC细胞的培养方法，其特征在于，包括步骤如下：获取未成熟DC细胞，将所述未成熟DC细胞置于培养基中；再向所述培养基中加入TLR激动剂进行培养至所述未成熟DC细胞成熟；其中，所述TLR激动剂包括多聚T寡脱氧核苷酸和咪唑喹啉衍生物，所述咪唑喹啉衍生物在所述培养基中的终浓度...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾宪卓，唐熙，
申请(专利权)人：深圳爱生再生医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44