一株抗呋喃它酮代谢物AMOZ的单克隆抗体杂交瘤细胞株YH4及其应用制造技术

一株抗呋喃它酮代谢物AMOZ的单克隆抗体杂交瘤细胞株YH4及其应用，属于食品安全免疫检测技术领域。本发明专利技术杂交瘤细胞株YH4，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.12017。抗呋喃它酮代谢物AMOZ单克隆抗体，它由所述杂交瘤细胞株YH4分泌产生。此细胞株YH4分泌的单克隆抗体，对呋喃它酮代谢物AMOZ具有较好的特异性（IC50值为0.2μg/L），有较好的检测灵敏度和亲和力，可用于食品安全中抗呋喃它酮代谢物AMOZ的特异性检测。还提供了一种新的合成呋喃它酮代谢物AMOZ免疫原的方法，半抗原的合成步骤更加简化，有效，为今后人们的研究提供了合成免疫原的思路与方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一株抗呋喃它酮代谢物（AMOZ）的单克隆抗体杂交瘤细胞株YH4及其应用，属于食品安全免疫检测

技术介绍
呋喃它酮药物抗菌谱较广，对大多数革兰氏阳性菌、阴性菌均有抗菌作用，如金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、化脓性链球菌等。本品内服后在肠道不易吸收，故主要用于肠道感染，也可用于球虫病、火鸡黑头病的治疗。硝基呋喃类光谱抗生素（呋喃它酮、呋喃唑酮、呋喃妥因、呋喃西林）主要出现在动物性食品中。他们对人类健康有恶性影响，有致癌性，包括美国、加拿大和欧盟在内的很多国家都有对食物中应用的禁令。这些国家对所有含有硝基呋喃残留的进口食物都有禁令。AMOZ是呋喃它酮的代谢物，在一般的烹调中不易分解，在温和的酸性条件下可以从组织中释放出来，因此可以用来做检测使用。为了人和动物的安全很有必要对水源和食品（如：肉）进行该类抗生素残留检测。目前AMOZ的检测方法主要是高效液相色谱法（HPLC），液质联用法（LC-MS-MS）等紫外仪器方法，但是这些方法存在操作繁琐，耗时，费用比较贵等缺点，不能实现大量样品的快速检测。因此建立一种快速简便的AMOZ检测方法具有重要意义。酶联免疫法（ELISA）是一种极为高效、敏感、快速的检测方法，检测时对样本的纯度要求不高而且操作简便，适用于大量样本的现场快速检测。然而得到高特异性和高灵敏度的单克隆单体是免疫学检测的前提，其中人工抗原的合成是重要的一步。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一株抗AMOZ单克隆抗体杂交瘤细胞株，由该细胞株制备的抗体对AMOZ具有较好特异性和检测灵敏度，可以用来建立AMOZ的免疫学检测方法。本专利技术的技术方案，一株抗呋喃它酮代谢物AMOZ的单克隆抗体杂交瘤细胞株YH4，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号为CGMCC No.12017。抗呋喃它酮代谢物AMOZ单克隆抗体，它由所述保藏编号为CGMCC No.12017的抗呋喃它酮代谢物AMOZ单克隆抗体杂交瘤细胞株YH4分泌产生。所述抗呋喃它酮代谢物AMOZ单克隆抗体的应用，其在食品安全中呋喃它酮代谢物AMOZ残留检测中的应用。本专利技术提供的YH4细胞株的制备基本步骤为：（1）半抗原的合成：称取邻醛基苯甲酸（2-CBA）11.5mg于25mL圆底烧瓶中，加入纯水1.3mL，1M HCl溶液60μL，磁力搅拌下滴加DMF直至邻醛基苯甲酸完全溶解，加入呋喃它酮代谢物AMOZ 30mg，溶解后，连接冷凝管并置于60℃水浴锅中回流过夜，得到白色沉淀，将反应液过滤，把滤纸上的白色固体放在37℃烘箱烘干，即得到半抗原2-CP AMOZ；用液质连用技术进行鉴定与分析；（2）标准品的合成：利用硝基呋喃代谢物的氨基与邻硝基苯甲醛的醛基发生缩合反应而制成的，用邻硝基苯甲醛置换邻醛基苯甲酸即可得到标准品2-NPAMOZ，用液质连用技术进行鉴定与分析；（3）免疫原2-CPAMOZ-KLH的制备：称取步骤（1）制备的2-CPAMOZ 5.0mg，二环己基碳二亚胺（DCC）7.8mg，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS) 4.4mg，用0.6mL无水DMF溶解（称为A液），室温搅拌反应4h。称取KLH 10mg溶于4mL pH9.6的0.05mol/L 碳酸盐缓冲溶液中（称为B液），在室温条件，逐滴将A液加入到B液中，室温反应过夜，即得免疫原2-CPAMOZ-KLH混合液；（4）包被原2-CPAMOZ-OVA的制备：称取步骤（1）制备的2-CPAMOZ 5.0mg，碳二亚胺（EDC）7.2mg，NHS 4.4mg，用0.6mL无水DMF溶解（称为C液），室温搅拌反应4h。称取OVA 6mg溶于3mL pH9.6的0.05mol/L 碳酸盐缓冲溶液中（称为D液），在室温条件下逐滴将C液加入到D液中，室温反应过夜，即得包被原2-CPAMOZ-OVA混合液，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原，并通过紫外吸收扫描方法鉴定；（5）小鼠的免疫：取AMOZ完全抗原2-CPAMOZ-KLH与等量弗氏佐剂混合乳化后，通过背部皮下注射免疫BALB/c小鼠。第一次免疫用完全弗氏佐剂，之后都用不完全弗氏佐剂。首免与加强免之间间隔一个月，加强免之间间隔21天。最后一次用AMOZ完全抗原（不含佐剂）注射入小鼠腹腔冲击免疫；通过间接ELISA检测血清效价和抑制；（6）细胞融合与细胞株建立：通过聚乙二醇（PEG4000）法将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合，通过HAT培养基培养，利用间接ELISA检测阳性细胞孔，并进一步利用间接竞争ELISA法测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有最好抑制的阳性细胞孔进行三次亚克隆，最终筛选获得杂交瘤细胞株YH4；（7）杂交瘤细胞株性质的鉴定：通过ELISA法测定灵敏度和特异性。本专利技术的有益效果：本专利技术提供了一种新的半抗原合成的思路，通过衍生得到半抗原，从而得到灵敏度很好的单克隆抗体细胞株。通过本专利技术获得的抗AMOZ单克隆抗体细胞株YH4分泌的单克隆抗体，对AMOZ有较好的检测灵敏度和特异性，其IC50值为0.2μg/L。生物材料样品保藏：单克隆细胞株YH4，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.12017，保藏日期2016年1月20日。附图说明图1是YH4单克隆抗体的抑制标准曲线。具体实施方式本专利技术下面的实施例仅作为本
技术实现思路
的进一步说明，不能作为本专利技术的限定内容或范围。下面通过实施例对本专利技术作进一步说明。本专利技术通过将AMOZ完全抗原2-CPAMOZ-KLH免疫小鼠，通过细胞融合，HAT选择性培养基培养，通过间接ELISA和间接竞争ELISA筛选细胞上清，最终得到了对AMOZ有较好特异性和灵敏度的单克隆抗体杂交瘤细胞株。实施例1 杂交瘤细胞株YH4的制备（1）完全抗原及标准品的合成：称取邻醛基苯甲酸（2-CBA）11.5mg于25mL圆底烧瓶中，加入纯水1.3mL，1M HCl 60μL，磁力搅拌下滴加DMF直至邻醛基苯甲酸完全溶解，加入呋喃它酮代谢物AMOZ 30mg，溶解后，连接冷凝管并置于60℃水浴锅中回流过夜，得到白色沉淀，将反应液过滤，把滤纸上的白色固体放在37℃烘箱烘干，即得到半抗原2-CP AMOZ。用液质连用技术进行鉴定与分析。标准品的合成是利用硝基呋喃代谢物的氨基与邻硝基苯甲醛的醛基发生缩合反应而制成的，用邻硝基苯甲醛置换邻醛基苯甲酸即可，得到标准品2-NPAMOZ，用液质连用技术进行鉴定与分析。免疫原2-CPAMOZ-KLH的制备：称取2-CPAMOZ 5.0mg，DCC 7.8mg，NHS 4.4mg，用0.6mL无水DMF溶解（称为A液），室温搅拌反应4h。称取KLH 10mg溶于4mL pH9.6的0.05mol/L 碳酸盐缓冲溶液中（称为B液），在室温条件下逐滴将A液加入到B液中，室温反应过夜，即得免疫原2-CPAMOZ-KLH混合液；包被原2-CPAMOZ-OVA的制备：称取2-CPAMOZ 5.0mg，EDC 7.2mg，NHS 4.4mg，用0.6mL无水DMF溶解(称为C液)，室温搅拌反应4h。称取OVA 6mg溶于3本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株抗呋喃它酮代谢物AMOZ的单克隆抗体杂交瘤细胞株YH4，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号为CGMCC No.12017。

【技术特征摘要】
1.一株抗呋喃它酮代谢物AMOZ的单克隆抗体杂交瘤细胞株YH4，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号为CGMCC No.12017。2.抗呋喃它酮代谢物AMOZ单克隆抗体，其特征在于：它由所...

【专利技术属性】
技术研发人员：匡华，丁西，胥传来，徐丽广，马伟，吴晓玲，刘丽强，宋珊珊，胡拥明，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32