本发明专利技术公开了多点突变单管快速检测方法及试剂盒。多点突变单管快速检测方法，包括：1）设计ARMS引物及对应的下游引物、中介连接引物、通用荧光探针及其淬灭探针；2）将ARMS引物及对应的下游引物、中介连接引物、通用荧光探针及其淬灭探针与热启动快速Taq酶系统混合，扩增；3）检测反应体系的荧光变化，确定是否存在点突变。本发明专利技术的发明专利技术，操作简单，可以定性检测出多点突变的存在。本发明专利技术的检测方法中使用的引物设计难度低，大幅降低了引物合成的成本；克服了现有ARMS技术的局限性，大大提高了其检测通量；实现了1管反应取代了之前的多管检测，节省人力物力。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种突变检测试剂盒，特别涉及一种KRAS多点突变单管快速检测试 剂盒。
技术介绍
KRAS基因位于人类12号染色体上，是人肿瘤中常见的致癌基因。KRAS基因正常 时，能控制调控细胞生长的路径，可抑制肿瘤细胞生长。当发生突变时，会导致细胞内信号 传导紊乱，细胞增殖失控而癌变。 结直肠癌（colorectalcancer,CRC)是目前世界上发病率和死亡率最高的恶性肿瘤 之一，40%以上的结直肠癌患者确诊时肿瘤已经发生转移而失去根治性手术治疗的机会。目 前，分子靶向治疗已经成为国际国内转移性结直肠癌治疗的共识。如靶向EGFR的单克隆抗 体药物西妥昔单抗(商品名爱必妥）已经成为转移性结直肠癌治疗中的一线用药。 由于KRAS野生型的患者是抗EGFR单抗药物治疗的最大获益人群，KRAS基因大多 数的突变发生在2号外显子12、13密码子上，所以在使用抗EGFR单抗药物治疗前，2011年 NCCN《结肠癌临床实践指南（中国版)》推荐进行KRAS基因第12和13号密码子的突变检 测，从而基于患者肿瘤DNA中KRAS基因的突变状态来指导临床制定合适的治疗方案。 KRAS基因药物敏感的突变点，目前普遍认为需检测7个突变位点，市面上的荧光 PCR检测试剂盒普遍使用7个PCR管进行检测，分析过程繁琐而且没有必要。同时整个检测 流程较慢，至少需要2天才能出结果。 本专利使用多点突变并行检测技术，在单管中，可通过荧光基团的指示作用，在同 一个PCR反应中，即可同时检测出多个突变位点。不需分开几个PCR管分别进行。实现简 单，方便的KRAS点突变检测。【专利
技术实现思路
】 本专利技术的目的在于提供一种高效的KRAS多点突变单管快速检测方法及试剂盒。 本专利技术所采取的技术方案是： 多点突变单管快速检测方法，包括如下步骤： 1) 设计针对不同点突变的ARMS引物及对应的下游引物、中介连接引物、通用荧光探 针及其淬灭探针；其中，中介连接引物由通用序列部分和特异序列部分构成，通用序列部分 与通用荧光探针部分序列互补，特异序列部分与点突变下游的部分序列互补； 2) 将ARMS引物及对应的下游引物、中介连接引物、通用荧光探针及其淬灭探针与热 启动快速Taq酶系统混合，扩增； 3) 检测反应体系的荧光变化，确定是否存在点突变。 ARMS弓丨物对应的下游引物、中介连接引物、通用荧光探针优为简并的，即一条下 游引物、中介连接引物、通用荧光探针可以对应于多条。 作为上述方法的进一步改进，通用荧光探针上连接荧光基团的核苷酸和淬灭探针 上连接淬灭基团的核苷酸在互补配对后的间距不超过4个核苷酸，进一步的，不超过3个、 2个、1个或连接在相互配对的两个核苷酸上。 作为上述方法的进一步改进，中介连接引物中与突变位点下游的部分序列互补的 核酸数量不少于5bp，不少于10bp，特别的，互补的核酸数量为15~30bp。 作为上述方法的进一步改进，中介连接引物中与通用荧光探针部分核酸互补配对 的核酸数量不少于5bp，不少于10bp，特别的，互补的核酸数量为15~45bp。 互补序列的存在，有利于保证引物间存在足够的亲和力，保证检测结果的可靠性。 作为上述方法的进一步改进，通用荧光探针的一端连接有保护核酸序列。保护序 列的作用在于防止探针的关键序列不被反应体系中无意引入的核酸外切酶过早切除。保护 序列不与待测序列、引物等互补配对，可以是简单重复序列，如多个A、T、C、G等。 一种KRAS多点突变单管快速检测试剂盒，包括DNA提取液，热启动快速Taq酶系 统和KRAS突变检测引物，其特征在于：所述KRAS突变检测引物由多组ARMS引物及对应的 下游引物、中介连接引物、通用荧光探针及其淬灭探针组成；其中：中介连接引物的一端序 列与待KRAS突变位点下游的部分序列互补，另一端序列与通用荧光探针部分核酸互补配 对。 优选的，上述KRAS多点突变单管快速检测试剂盒中使用的中介连接引物中与 KRAS突变位点下游的部分序列互补的核酸数量不少于5bp，不少于10bp，特别的，互补的 核酸数量为15~30bp。 优选的，上述KRAS多点突变单管快速检测试剂盒中使用的中介连接引物中与通 用荧光探针部分核酸互补配对的核酸数量不少于5bp，不少于10bp，特别的，互补的核酸 数量为15~45bp。 特别的，上述KRAS多点突变单管快速检测试剂盒中使用的ARMS引物的序列如 下： ARMS引物 1:ACTTGTGGTAGTTGGAGCTGA ARMS引物 2:ACTTGTGGTAGTTGGAGCTGC ARMS引物 3:ACTTGTGGTAGTTGGAGCTGT ARMS引物 4:ACTTGTGGTAGTTGGAGCTA ARMS引物 5:ACTTGTGGTAGTTGGAGCTC ARMS引物 6:ACTTGTGGTAGTTGGAGCTT ARMS引物 7:GTGGTAGTTGGAGCTGGTGA ARMS引物1~7对应的下游引物为Y1:AITAAAACAAGAITTACCTCTA; ARMS引物1~7对应的中介引物为Z1 : GTCAGCCTTGCTAAGGCTACAGCTAATTCAGAATCAo 特别的，上述KRAS多点突变单管快速检测试剂盒中使用的通用荧光探针的序列 为： CT(dA-FAM)GAGCTCTACGTAGCCTTAGCAAGGCTGACTITITITITITTTITITT，对应的淬灭序列 为：5'BHQ-GCTCTAG-3'。 热启动快速Taq酶系统的组成为dNTPS(U)、UNG酶、热启动快速Taq酶。 本专利技术的有益效果是： 本专利技术操作简单，可以定性检测出多点突变的存在。本专利技术的检测方法中使用的引物 设计难度低，大幅降低了引物合成的成本。 本专利技术检测方法克服了现有ARMS技术的局限性，大大提高了其检测通量。 本专利技术的检测方法实现了多管检测反应的简易性，1管反应取代了之前的多管检 测，节省人力物力。 本专利技术的检测方法中使用快速Taq酶，比普通Taq酶更好。【附图说明】 图1到图6是本专利技术检测方法的原理图； 图7是等浓度模板在不同Taq酶反应条件下的PCR扩增曲线，说明本试剂盒中使用的 快速Taq酶比普通Taq酶的扩增效果好。【具体实施方式】 下面结合附图，进一步说明本专利技术的检测原理。 以KRAS突变点12Asp为例，该点的野生型为G，突变型为A，在PCR过程中，首先使 用1对引物，含1条针对突变点的ARMS引物（引物最后一个碱基为A)和下游引物。该引物 在快速酶的作用下特异性的扩增出突变位点A。野生型位点G不被扩增，如图1所示； 当特异性扩增发生后，在ARMS引物的引导下，快速Taq酶沿着DNA模板，向5'_3'方向 移动并水解中介连接引物的序列介导区域，而中介连接引物的探针互补区域则被释放，如 图2、图3所示； 释放出来的探针互补区域，基于碱基互补配对原则，与通用荧光探针发生互补，在淬灭 基团的存在下，荧光基团的荧光被淬灭，如图4所示； 快速Taq酶通过中介连接引物的探针互补区域，向5' -3'方向移动，水解淬灭基团，从 而淬灭基团远离荧光基团，从而PCR反应产生了荧光，如图5、图6所示。 因此，只要多个个突变位点的ARMS引物、下游引物和中介本文档来自技高网...
【技术保护点】
多点突变单管快速检测方法，包括如下步骤：a)设计针对不同点突变的ARMS引物及对应的下游引物、中介连接引物和通用荧光探针，其中，中介连接引物由与通用荧光探针部分序列互补的通用序列部分和与点突变下游的部分序列互补的特异部分组成；b)将ARMS引物及对应的下游引物、中介连接引物和通用荧光探针与快速Taq酶系统混合，扩增；c)检测反应体系的荧光变化，确定是否存在点突变。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈华云，陈嘉昌，刘淑园，肖湘文，丁渭，张天海，赵丽，方凤银，邓利琼，
申请(专利权)人：广州和实生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44
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