一种同时检测水生动物败血症三种致病菌的多重PCR引物组及检测方法技术

本发明专利技术公开了一种同时检测水生动物败血症三种致病菌的多重PCR引物组及方法。本发明专利技术检测方法根据嗜水气单胞菌，维氏气单胞菌和鮰爱德华氏菌，分别设计和筛选出了三对特异性引物，通过多重PCR反应可以快速准确地检测水生动物败血症中的嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌和鮰爱德华氏菌。本发明专利技术可以同时检测水生动物败血症的三种病原菌，检测所需时间短、灵敏度高、特异性好，与常规病原诊断方法相比更加快捷、经济，因此，可以用于水生动物败血症病的快速诊断和大规模的分子流行病学调查。

【技术实现步骤摘要】
—种同时检测水生动物败血症三种致病菌的多重PCR引物组及检测方法
本专利技术涉及一种多重PCR检测方法，具体涉及一种同时检测水生动物败血症三种致病菌的多重PCR引物组及检测方法。
技术介绍
细菌性败血症又叫淡水鱼类暴发性流行病，最早于1986年发现，1989年起开始在全国大范围流行，很多水产养殖动物都可感染，如鲫、鳊、鲤、鲢、鳙、草鱼，斑点叉尾鮰等。该病的发病率和死亡率均很高，是我国养鱼史上危害鱼的种类最多、流行地区最广、流行季节最长、造成的损失最严重的一种急性传染病。嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophiIa，_是引起水生动物细菌性败血症的主要致病菌，近年来维氏气单胞菌(Aeromonas veronii, AV)是也引起多种水生动物发生多器官败血症的常见致病菌，在斑点叉尾鮰中引起败血症的症状的主要病原菌为鮰爱德华氏菌iEdwardsiella ictaluri, EI)。基于现有技术检测水产动物致病菌大多沿用传统的病样细菌分离培养及鉴定等方法，而该方法检测步骤繁琐，周期较长，灵敏度低。在应对突发的疾病发生事件时，不能满足诊断及时、结果准确、灵敏度和特异性高以及大量样品检测的要求。鉴于此，为了能够实现快速对水生动物中多种致病菌的诊断和监控，各国学者研究出了一些新的观点和方法，如酶联免疫分析法(EILISA)、荧光免疫分析法(FIA)和聚合酶链反应(PCR)。针对嗜水气单胞菌、鮰爱德华氏菌等单一致病菌的PCR检验方法已经建立起来法，在水产动物败血症基本上都是沿用普通PCR方法，通常一次只能检测一种致病菌，检测时间长且常常造成漏检或误检。然而，水生动物养殖过程中，需要对鱼类突发败血症病的致病菌进行快速检测和分子流行病学调查，其样本量大、时间紧，采用单一致病菌的PCR检测技术和一般方法不能满足要求，因此，建立简便、快速、准确、可靠的检测方法同时适用于这三种主要病原菌的检测方法尤为重要。
技术实现思路
为了解决上述存在的问题，本专利技术提供了一种可以同时检测水生动物败血症致病菌的多重PCR检测方法。本专利技术的目的在于提供一种同时检测水生动物败血症三种致病菌的多重PCR引物组。本专利技术的另一目的在于提供一种同时检测水生动物败血症三种致病菌的多重PCR检测方法。本专利技术所采取的技术方案是: 一种同时检测水生动物败血症三种致病菌的多重PCR引物组，其核苷酸序列分别如下所示: 嗜水气单胞菌引物组的核酸序列如下:AH-Fl:5’ -CAGCGTCCAATACCTGGTGTTA-3’ (SEQ ID NO: 1)，或者为该序列的核酸互补序列； AH-Rl:5’-GCGGGTACGACGCACCTTGC-3’ (SEQ IDNO: 2)，或者为该序列的核酸互补序列； 维氏气单胞菌引物组的核酸序列如下: AV-F2:5’-AGCCAAGCAGGATCTGGTGAAG-3’ (SEQ ID NO: 3)，或者为该序列的核酸互补序列； AV-R2:5’-CTTGTTGAACTCGGGGCTCGCT-3’ (SEQ ID NO:4)，或者为该序列的核酸互补序列； 鮰爱德华氏菌引物组的核酸序列如下: E1-F3:5’ -CCAATTACGTGAGGATACGGCG-3’ (SEQ ID NO: 5)，或者为该序列的核酸互补序列； E1-R3:5’-CCCCGGCGGTTATACAGACG-3’ (SEQ ID NO:6)，或者为该序列的核酸互补序列。一种同时检测水生动物败血症三种致病菌的多重PCR检测方法，包括以下步骤: 1)DNA模板的制备； 2)多重PCR扩增体系如下: 2Xmix23~27 μ L 10 μ mol/L AH-FlI~3 μ L 10 μ mol/L AH-Rl1-3 μ L 10 μ mol/L AV-F2I~3 μ L 10 μ mol/L AV-R2I~3 μ L 10ymol/LE1-F3I~3 μ L 10ymol/LE1-R3I~3 μ L DNA模板I~2 μ L ddH20加至 50 μ L ; 3)多重PCR扩增条件为:94~96°C预变性3~6min，94~95°C变性45~55s，55~60°C退火25~35s，72°C延伸5(T60s，进行28~35个循环后，然后再72°C温度延伸7~10 min，完成PCR扩增，扩增产物4°C保存； 4)PCR产物检测:将PCR扩增产物进行电泳、凝胶成像观察，若有1091 bp的条带说明样品中有嗜水气单胞菌，若有262 bp的条带说明样品中维氏气单胞菌，若有450 bp的条带说明样品中有鮰爱德华氏菌，若这种大小的条带都不存在，说明样品中嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌和鮰爱德华氏菌这三种菌为阴性。进一步的，步骤I)所述的DNA模板制备的具体操作为:将待测水产动物的组织匀浆液750~850 g离心4~6min，取上清，900(Tl1000g离心8~12min，收集沉淀，加入0.1M的TE缓冲液，95~100°C处理8~12min ;900(Tl1000g离心8~12min，收集上清液即待测DNA模板。进一步的，步骤2)所述的多重PCR扩增体系为: 2Xmix25 μ L 10 μ mol/L AH-FlI μ L 10 μ mol/L AH-RlI μ L 10 μ mol/L AV-F23μ L10 μ mol/L AV-R23μ L 10 μ mol/L E1-F32 μ L 10 μ mol/L E1-R32 μ L DNA模板I μ L ddH20加至 50 μ L。进一步的，上述2Xmix 含有 Taq DNA Polymerase, 2XTaq PCR Buffer, 3 mM MgCl2和 400 μΜ dNTP ο进一步的，步骤3)所述的多重PCR扩增条件为:95°C预变性4min，94°C变性50 S，59 °C退火30 s，72°C延伸I min，进行30个循环后，然后再72°C温度延伸10 min，完成PCR扩增，扩增产物4°C保存。本专利技术的有益效果是: 本专利技术可以同时检测水生动物败血症的三种病原菌，检测所需时间短、灵敏度高、特异性好，与常规病原诊断方法相比更加快捷、经济，可以用于水生动物败血症病的快速诊断和大规模的分子流行病学调查。【附图说明】图1为嗜水 气单胞菌特异性检测结果；Ah:嗜水气单胞菌，1:霍乱弧菌F2，2:溶藻弧菌Ecgy0608，3:海豚链球菌ATCC29177，4:无乳链球菌XQ-1，5:弗氏柠檬酸杆菌HD1003，6:迟缓爱德华氏菌1101，7:蛳鱼诺卡氏菌012L1，8:舒氏气单胞菌WL-1，9:温和气单胞菌Ptl41，10:柱状黄杆菌G4 ； 图2为维氏气单胞菌特异性检测结果，Av:维氏气单胞菌，1:霍乱弧菌F2，2:溶藻弧菌Ecgy0608，3:海豚链球菌ATCC29177，4:无乳链球菌XQ-1，5:弗氏柠檬酸杆菌HD1003，6:迟缓爱德华氏菌1101，7:蛳鱼诺卡氏菌012L1，8:舒氏气单胞菌WL-1，9:温和气单胞菌Ptl41，10:柱状黄杆菌G4 ； 图3为鮰爱德华氏菌特异本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种同时检测水生动物败血症三种致病菌的多重PCR引物组，其核苷酸序列分别如下所示：嗜水气单胞菌引物组的核酸序列如下：AH‑F1：5’‑CAGCGTCCAATACCTGGTGTTA‑3’（SEQ ID NO :1），或者为该序列的核酸互补序列；AH‑R1：5’‑GCGGGTACGACGCACCTTGC‑3’（SEQ ID NO :2），或者为该序列的核酸互补序列；维氏气单胞菌引物组的核酸序列如下：AV‑F2：5’‑ AGCCAAGCAGGATCTGGTGAAG‑3’（SEQ ID NO :3），或者为该序列的核酸互补序列；AV‑R2：5’‑ CTTGTTGAACTCGGGGCTCGCT‑3’（SEQ ID NO :4），或者为该序列的核酸互补序列；鮰爱德华氏菌引物组的核酸序列如下：EI‑F3：5’‑CCAATTACGTGAGGATACGGCG‑3’（SEQ ID NO :5），或者为该序列的核酸互补序列；EI‑R3：5’‑CCCCGGCGGTTATACAGACG‑3’（SEQ ID NO :6），或者为该序列的核酸互补序列。

【技术特征摘要】
1.一种同时检测水生动物败血症三种致病菌的多重PCR引物组，其核苷酸序列分别如下所示: 嗜水气单胞菌引物组的核酸序列如下: AH-Fl:5’ -CAGCGTCCAATACCTGGTGTTA-3’ (SEQ ID NO: 1)，或者为该序列的核酸互补序列； AH-Rl:5’-GCGGGTACGACGCACCTTGC-3’ (SEQ IDNO: 2)，或者为该序列的核酸互补序列； 维氏气单胞菌引物组的核酸序列如下: AV-F2:5’-AGCCAAGCAGGATCTGGTGAAG-3’ (SEQ ID NO: 3)，或者为该序列的核酸互补序列； AV-R2:5’-CTTGTTGAACTCGGGGCTCGCT-3’ (SEQ ID NO:4)，或者为该序列的核酸互补序列； 鮰爱德华氏菌引物组的核酸序列如下: E1-F3:5’ -CCAATTACGTGAGGATACGGCG-3’ (SEQ ID NO: 5)，或者为该序列的核酸互补序列； E1-R3:5’-CCCCGGCGGTTATACAGACG-3’ (SEQ ID NO:6)，或者为该序列的核酸互补序列。2.一种同时检测水生动物败血症三种致病菌的多重PCR检测方法，其特征在于:包括以下步骤: 1)DNA模板的制备； 2)多重PCR扩增体系如下: 2Xmix23~27 μ L 10ymol/L AH-Fl1~3 μ L 10ymol/L AH-Rl1-3 μ L 10ymol/L AV-F21~3 μ L 10ymol/L AV-R21~3 μ L 10ymol/LE1-F31~3 μ L 10ymol/LE1-R31~3 μ L DNA模板1~2 μ L ddH20加至 50 μ L ; 3)多重PCR扩增条件为:94~96°C预变性3~6min，94~95°C变性45~55s，55~60°C退火25~35s，72°C延伸5(T60s，进行28~35个循环后，然后再72°C温度延伸7~10 min，完成PCR扩增，扩增产...

【专利技术属性】
技术研发人员：张德锋，刘礼辉，吴淑勤，李宁求，石存斌，付小哲，林强，任燕，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院珠江水产研究所，
类型：发明
国别省市：广东;44