兰科植物授粉成功与否的鉴定方法技术

本发明专利技术公开了一种兰科植物授粉成功与否的鉴定方法，提取兰科植物被测植株授粉前后各时期的基因组DNA；双酶切和连接；预扩增和选择性扩增；聚丙烯酰胺凝胶电泳,银染：选择性扩增产物经过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离和银染后获得所需条带；获得授粉后差异甲基化差异片段；从聚丙烯酰胺胶上挖取授粉后子房特异差异甲基化片段；将获得的授粉后差异甲基化差异片段进行回收、克隆及测序；选择与授粉后子房发育有密切关系的片段作为分子标记,按照标记成探针后，分别与授粉后各时期植株基因组DNA进行Southern杂交，若杂交结果成阳性，则被测植株授粉成功，确定子房启动发育时间，若杂交结果成阴性，则被测植株授粉未成功，确定子房未启动发育时间。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，特别是涉及一种。
技术介绍
兰科植物发育的一个独特特点是子房发育时间较长，且只有在授粉后才启动发育，形成种子非常细小。不同于大多数被子植物，兰花在授粉后子房才开始发育，发育间期较长，一般情况下，对于兰科植物授粉成功与否没有适宜简便的方法判断。兰科植物如果未真正受精(授粉未成功)，子房也会膨大，因此只能等待最后结果(子房凋谢或继续生长)，这样增加了鉴别受精与否、种子合成成功与否的时间，不仅增加了培育成本，而且会影响其他枝条上花的授粉。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术中存在的技术缺陷，而提供一种。为实现本专利技术的目的所采用的技术方案是:一种兰科 植物授粉成功与否的鉴定方法，包括下述步骤:(I)提取兰科植物被测植株授粉前后各时期的基因组DNA，稀释后作为反应模板；(2)双酶切和连接:用识别四碱基的Hpa II和Msp I同裂酶分别与识别六碱基的核酸内切酶EcoR I组合对步骤(1)得到的反应模板DNA进行双酶切和连接；(3)预扩增和选择性扩增:将步骤(2)所得的连接产物应用AFLP技术进行预扩增和选择性扩增；(4)聚丙烯酰胺凝胶电泳本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种兰科植物授粉成功与否的鉴定方法，其特征在于，包括下述步骤：(1)提取兰科植物被测植株授粉前后各时期的基因组DNA，稀释后作为反应模板；(2)双酶切和连接：用识别四碱基的Hpa Ⅱ和Msp Ⅰ同裂酶分别与识别六碱基的核酸内切酶EcoR Ⅰ组合对步骤(1)得到的反应模板DNA进行双酶切和连接；(3)预扩增和选择性扩增：将步骤(2)所得的连接产物应用AFLP技术进行预扩增和选择性扩增；(4)聚丙烯酰胺凝胶电泳,银染：选择性扩增产物经过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离和银染后获得所需条带；(5)获得授粉后差异甲基化差异片段：比较授粉前后EcoRI+HpaII和EcoRI+MspI双泳道的带型，重点分析授粉后...

【技术特征摘要】
1.一种兰科植物授粉成功与否的鉴定方法，其特征在于，包括下述步骤: (1)提取兰科植物被测植株授粉前后各时期的基因组DNA，稀释后作为反应模板； (2)双酶切和连接:用识别四碱基的HpaII和Msp I同裂酶分别与识别六碱基的核酸内切酶EcoR I组合对步骤(1)得到的反应模板DNA进行双酶切和连接； (3)预扩增和选择性扩增:将步骤(2)所得的连接产物应用AFLP技术进行预扩增和选择性扩增； (4)聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染:选择性扩增产物经过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离和银染后获得所需条带； (5)获得授粉后差异甲基化差异片段:比较授粉前后EcoRI+Hpall和EcoRI+MspI双泳道的带型，重点分析授粉后植株中有带而未授粉子房中无甲基化差异带的情形；从聚丙烯酰胺胶上挖取授粉后子房特异差异甲基化片段； (6)将步骤(5)获得的授粉后差异甲基化差异片段进行回收、克隆及测序； (7)选择与授粉后子房发育有密切关系的片段作为分子标记，按照标记成探针后，分别与授粉后各时期植株基因组DNA进行Southern杂交，若杂交结果成阳性，则被测植株授粉成功，确定子房启动发育时间，若杂交结果成阴性，则被测植株授粉未成功，确定子房未启动发育时间。2.根据权利要求1所述的兰科植物授粉成功与否的鉴定方法，其特征在于，所述兰科植物为大花蕙兰。3.根据权利要求1或2所述的兰科植物授粉成功与否的鉴定方法，其特征在于，步骤(2)中，第一个酶切反应体系的组成为:5XRT buffer2yL，步骤⑴得到的模板DNAlyL，EcoR 10.2 μ L，Hpa II 0.2 μ L，三蒸水6.6 μ L ;酶切反应条件为在37°C保温20h ;第二个酶切反应体系的组成为:5XRT buffer2y L，步骤(1)得到的模板DNAl μ L7EcoR 10.2 μ L,Msp10.2 μ L，三蒸水6.6 μ L ;酶切反应条件为在37°C保温20h。4.根据权利要求3所述的兰科植物授粉成功与否的鉴定方法，其特征在于，连接的接头包括与EcoR I酶切位点互补的人工接头即E接头和与Hpa II /PMsp I酶切位点互补的人工接头即Η/M接头，所述E接头的引物序列分别为:GACGATGAGTCTAGAA和CGTTCTAGACTCATC,所述Η/M接头的引物序列分别为:CTCGTAGACTGCGTACC和AATTGGTACGCAGTC ； 所述连接体系的组成为:两个所述酶切反应体系的酶切混合液IO μ L，5 X RTbuffer4 μ L,浓度为5pmol的E接头I μ L,浓度为5pmol的Η/Μ接头I μ L,浓度为5mmol/L的ATP0.8 μ L，浓度为350U/ μ L的T4DNA连接酶0.1 μ L，灭菌三蒸水3.1 μ L ;连接条件为:16°C保温过夜；连接完成后，65°C保温IOmin。5.根据权利要求1或2所述的兰科植物授粉成功与否的鉴定方法，其特征在于，所述预扩增引物序列为:GACTGCGTACCAATTC (EOO)和 GATGAGTCTAGAACGG (Η/Μ00)； 所述预扩增的体系为:体系总体积为25 μ L，其中，IOXPCR buffer2.5 μ L，浓度为IOmmoI/L 的 dNTP0.5 μ L,浓度为 25 μ mol/L E000.5 μ L,浓度为 25 μ mol/L Η/Μ000.5 μ L，步骤(2)所得DNA连接产物I μ L，浓度为5U/ μ L的Taq酶0.1 μ L，余量为灭菌三蒸水；反应条件为:94°C 30 s ,56°C lmin,72°C min,21cycles ；72°C延伸 lOmin。6.根据权利要求1或2所述的兰科植物授粉成功与否的鉴定方法，其特征在于，所述选择扩增的引物序列为: GACTGCGTACCAATTCAA (Ell) GATGAGTCTAGAACGGTA (H/...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈小强，赵新海，新楠，孙永健，孙宁，刘阳，
申请(专利权)人：天津农学院，
类型：发明
国别省市：天津;12