鳕科鳕鱼成分的实时荧光PCR检测方法技术

本发明专利技术涉及鳕科鳕鱼成分的实时荧光PCR检测方法。首次揭示一种可特异性鉴定鳕科鳕鱼成分的引物，所述引物针对含有鳕科鳕鱼成分的DNA可发生特异性扩增，而对没有鳕科鳕鱼成分的DNA不发生特异性扩增。采用本发明专利技术的方法，具有良好的再现性、灵敏度。

【技术实现步骤摘要】
鳕科鳕鱼成分的实时荧光PCR检测方法
本专利技术涉及物种检测领域，更具体地，本专利技术涉及鳕科鳕鱼成分的实时荧光PCR检测方法。
技术介绍
鳕科鳕鱼(Gadidae)属脊椎动物门(Vertebrata)、真骨鱼纲(Teleostei)、鳕形目(Gadiformes) 0鳕鱼具有高营养、低胆固醇、易于被人体吸收等优点。鳕科鳕鱼是最常见的鳕鱼种类，有许多经济价值极高的世界级重要经济鱼类，已知全世界鳕科鳕鱼类有50多种，它们中大多数分布于大西洋北部大陆架海域；重要鱼种有太平洋鳕、大西洋鳕、黑线鳕、蓝鳕、绿青鳕、牙鳕、挪威长臂鳕和狭鳕等。世界鳕鱼的年产量约占世界鱼产量的15-18%。鳕科鳕鱼中最主要的狭鳕，主要生产国为苏联、日本、朝鲜及美国等，其次为大西洋鳕，主要生产国有加拿大、冰岛、挪威、丹麦、英国、苏联等，我国生产的鳕鱼是叫做太平洋鳕鱼(俗称大头鳕)，我国市面上较常见的鳕鱼有大西洋鳕、太平洋鳕、狭鳕、黑线鳕等，大部分属于鳕科。近些年来市场上鳕鱼及其制品的消费逐渐上升，然而过度捕捞和缺乏保护措施，鳕鱼的资源量大减，不法商贩以低价值鱼及其制品代替鳕鱼及其制品出售，牟取暴利，一方面大大损害了消费者的利益，另一方面也造成了不正当的商业竞争。1999年12月17日，欧洲委员会制定了 104/2000号法令，该法令针对的是渔业、农业产品市场的参与者，法令规定鱼类及其制品除非贴上商品名称、生产方法和捕获区域的标签，否则该鱼类及其制品不能用于零售。该法令强制所有成员国制定并发布一项名单，名单包括能在商业上获得的鱼类的俗名和学名。在市场上出售的鳕鱼制品中，物种的原始可识别形态特征消失，这使得物种的鉴别变得相对困难。建立一种可以对鳕科鳕鱼DNA进行特异性检测的准确性高、实用性强的方法非常必要的。 国内外学者运用普通PCR方法和实时荧光PCR方法对大西洋鲑、黄鳍金枪鱼、长鳍金枪鱼、鲨鱼等鱼类物种鉴定做了大量研究。国外已有研究报道检测鉴别大西洋鳕鱼、太平洋鳕鱼、狭鳕等鳕科的某一物种，Beatriz Herrero等用TaqMan实时荧光PCR检测新鲜、冷藏、加工的产品中的大西洋鳕鱼成分。鶴田小百合等根据cytb基因设计了特异性引物，建立了 TaqMan实时荧光PCR检测和鉴定太平洋鳕，阿拉斯加狭鳕的方法。Martin 1.Taylor等建立了实时荧光PCR同时鉴定大西洋鳕，黑线鳕和牙鳕的方法。然而，鉴于鳕科鳕鱼难以找到有代表性的检测手段，目前本领域未见鳕科鳕鱼的检测方法的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供鳕科鳕鱼成分的实时荧光PCR检测方法。在本专利技术的第一方面，提供一种特异性鉴定鳕科鳕鱼成分的方法，所述方法包括:以待测样品的DNA为模板，以SEQ ID NO:1和SEQ ID NO: 2所示的引物以及SEQ ID NO: 3所示的探针进行实时荧光PCR检测。在一个优选例中，所述的待测样品是食品、饲料、水产品或遗传物质材料。在另一优选例中，所述方法的检测灵敏度为0.1ng/μ L鳕科鳕鱼DNA。在另一优选例中，所述的鳕科鳕鱼选自:蓝鳕(Micromesistius poutassou)、南鍾(mutaenolepis microps)、黑线鍾(Melanogrammus aeglefinus)、狭鍾(Theragrachalcogramma)、青鍾(Pollachius pollachius)、太平洋鍾(Gadus macrocephalus)、大西洋鍾(Gadus macrocephalus)、青绿鍾(Pollachius virens)。在本专利技术的另一方面，提供一种引物，所述引物是引物对，其序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2 所示。在本专利技术的另一方面，提供一种探针，所述的探针序列如SEQ ID N0:3所示。在本专利技术的另一方面，提供所述的引物和/或所述的探针的用途，用于从待测样品中鉴定鳕科鳕鱼成分。 在本专利技术的另一方面，提供一种鉴定鳕科鳕鱼成分的试剂盒，其中包括所述的引物和/或所述的探针。在一个优选例中，所述试剂盒中还包括:含有鳕科鳕鱼成分的检测标准品。在另一优选例中，所述试剂盒中还包括选自以下的试剂:DNA提取试剂，Taq酶，PCR缓冲液，DNA聚合酶，和/或说明鉴定鳕科鳕鱼成分的方法的使用说明书。本专利技术的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。【附图说明】图1、鳕科鳕鱼成分的物种特异性实时荧光PCR检测图。1:狭鳕；2:青鳕；3:太平洋鳕；4:大西洋鳕鱼；5:青绿鳕；6:蓝鳕；7:黑线鳕；8:南鳕。图2、鳕科鳕鱼DNA配比的实时荧光PCR检测灵敏度图。I:0.1ng/ μ L 太平洋鳕 DNA ；2:0.1ng/ μ L 大西洋鳕 DNA ；3:0.1ng/ μ L 狭鳕 DNA ；4:0.1ng/ μ L 青绿鳕 DNA ；5:0.1ng/ μ L 青鳕 DNA。图3、鳕科鳕鱼粉重量比的实时荧光PCR检测灵敏度图。1:0.01 % 太平洋鳕；2:0.01 % 大西洋鳕；3:0.01 % 狭鳕；4:0.01 % 青绿鳕；5:0.01%青鳕。图4、实际样品检测结果。【具体实施方式】本专利技术人经过广泛而深入的研究和试验，首次揭示一种可特异性鉴定鳕科鳕鱼成分(较佳地选自蓝鳕、南鳕(mutaenolepis microps)、黑线鳕、狭鳕、青鳕、太平洋鳕、大西洋鳕、青绿鳕)的引物，所述引物针对含有鳕科鳕鱼成分的DNA可发生特异性扩增(获得阳性结果)，而对没有鳕科鳕鱼成分的DNA不发生特异性扩增(获得阴性结果)。为了简化PCR扩增方法，本专利技术人还设计了配合所述引物的、用于进行实时荧光PCR的Taqman探针。采用所述的引物配合Taqman探针，可良好地应用于鉴定鳕科鳕鱼成分，并且具有良好的再现性、灵敏度。鳕鱼的品种非常多，鳕形目下包括鳞鳗鳕亚目、鳕亚目、长尾鳕亚目和蛇鐦亚目4亚目11个科约162属708种。目前常被捕捞的主要包括鳕科、无须鳕科和长尾鳕科的鳕鱼。鳕科鳕鱼包括有许多经济价值极高的世界级重要经济鱼类，已知全世界鳕科鳕鱼类有50多种，它们中大多数分布于大西洋北部大陆架海域；重要鱼种有太平洋鳕、大西洋鳕、黑线鳕、蓝鳕、绿青鳕、牙鳕、挪威长臂鳕和狭鳕等。鉴于鳕鱼种类繁多，从如此多的种类中找到对于鳕科鳕鱼特异性的鉴定试剂非常困难。需要考虑的不仅仅是鳕科鳕鱼这类物种的基因序列，而是需要考虑不要与其它与之具有亲缘关系的诸多物种产生交叉反应，这是非常困难的。例如，澳洲无须鳕、阿根廷无须鳕、南非无须鳕、北太平洋无须鳕为无须鳕科的物种，它们并非鳕科的物种，但要将它们与鳕科鳕鱼区分，目前而言尚缺乏检测手段。为此，本专利技术人经过了长期的研究和筛选，深入比对鳕科鳕鱼物种内的保守性和非鳕科鳕鱼物种间的差异性，经过针对各种样本的反复试验验证，最终确定了适用于鉴定鳕科鳕鱼的特异性引物和探针序列，即SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物以及SEQ IDNO:3所示的探针。如本文所用，所述的“鳕科鳕鱼成分”是指特异性来自于鳕科鳕鱼(Gadidae)的成分，可以是鳕科鳕鱼本身或其加工产品。所述的“鳕科鳕鱼(Gadidae) ”是鳕形目(Gadiformes)下面的“鳕科”的物种。较本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种特异性鉴定鳕科鳕鱼成分的方法，其特征在于，所述方法包括：以待测样品的DNA为模板，以SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物以及SEQ ID NO:3所示的探针进行实时荧光PCR检测。

【技术特征摘要】
1.一种特异性鉴定鳕科鳕鱼成分的方法，其特征在于，所述方法包括: 以待测样品的DNA为模板，以SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物以及SEQ ID NO:3所示的探针进行实时突光PCR检测。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的待测样品是食品、饲料、水产品或遗传物质材料。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法的检测灵敏度为0.1ng/yL鳕科鳕鱼 DNA。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的鳕科鳕鱼选自:蓝鳕(Micromesistius poutassou)、南鍾(mutaenolepis microps)、黑线鍾(Melanogrammusaeglefinus)、狭鍾(Theragra chalcogramma)、青鍾(Pollachius pollachius)、太平洋鍾(Gadus mac...

【专利技术属性】
技术研发人员：张舒亚，印丽萍，张坤，樊彦莉，郑江，陈颖，
申请(专利权)人：上海出入境检验检疫局动植物与食品检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：上海;31