本发明专利技术公开了PIK3CA基因突变荧光定量PCR分型检测试剂盒，包括PCR混合反应液、阳性对照品和用于检测PIK3CA基因突变基因型的荧光探针，所述PCR混合反应液中包含扩增突变位点所处PIK3CA基因区段的PCR引物。另外，本发明专利技术还公开了一种PIK3CA基因突变荧光定量PCR分型检测方法，利用本发明专利技术的试剂盒对PIK3CA基因突变分型进行荧光定量PCR检测。采用本发明专利技术的技术手段，能够实现对组织中PIK3CA基因突变情况的检测，尤其能够实现对PIK3CA基因第542、545和1047核苷酸突变的快速、准确、高灵敏度检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学领域，具体涉及ー种检测基因突变的荧光定量PCR试剂盒及其检测方法，尤其涉及ー种PIK3CA基因突变荧光定量PCR分型检测试剂盒及其检测方法。
技术介绍
PIK3CA(phosphatidylinositol 3-kinase catalytic alpha)是由 Volinia 等1994年利用原位杂交技术检测到的，是新近发现的一种体细胞突变的癌基因，其可能通过參与PIK3/AKT细胞信号转导途径调节细胞的生长和凋亡。研究证明PIK3CA与多种恶性肿瘤有关，如结直肠癌、宫颈癌、乳腺癌、肺癌等。目前关于癌基因PIK3CA与肿瘤的关系及其致瘤机制都成为人们研究肿瘤的ー个热点。人类肿瘤的发生是ー个多基因、多机制參与的过程，癌基因PIK3CA的发现为我们研究肿瘤的发生发展提供了新的方向。研究肿瘤不同阶段中PIK3CA突变的规律及其预后的关系，对于临床早期检测肿瘤及判断预后有重要的意义。癌基因PIK3CA是在关于PI3Ks家族与肿瘤的发生关系及其机制的研究中发现的。PIK3CA基因定位于3q26. 3，长34kb，包含20个外显子，编码1068种氨基酸，该组氨基酸产生ー组长124kD的蛋白。PIK3CA编码I类磷脂酰肌醇_3_激酶(phosphatidylino-sitol3-kinases, PI3Ks)的 p 110 催化亚单位，即 PI3Kpll0a。Broderick 等研究发现 PIK3CA 是ー种癌基因，生理情况下，基因PIK3CA在正常脑、肺、乳腺、胃肠、宫颈、卵巣等组织中均有表达，具有调控体细胞増殖、分化、存活等许多重要的生理功能，但多以非激活的形式存在，通常不易检测到，而其突变后基因及其蛋白均可过度表达，可被检测到。研究表明，PIK3CA基因的突变不仅可以引起PI3Ks的催化活性增强，并且可促进细胞癌变。根据PIK3CA基因在结直肠癌中高频突变，并激活PI3K/AKT信号传导通路这ー研究成果，阻断该信号通路对AKT的磷酸化有望成为治疗结直肠癌的一条有效途径。发现PIK3CA基因突变在结肠癌癌变过程中的作用，进ー步认识癌基因PIK3CA突变作用对于揭示大肠癌发生发展的分子机制具有重要意义，为结肠癌的早期发现、早期治疗及预后提供理论依据。癌基因PIK3CA编码的蛋白PI3Kpll0a在大肠癌变不同阶段的表达差异提示检测PI3Kpll0a反应癌基因PIK3CA的突变，可成为预测肿瘤分化，判断大肠癌预后的ー个重要指标，也为临床早期警示大肠癌变提供了依据。另外，PIK3CA在宫颈癌组织中表达明显高于正常组织，PIK3CA基因的表达产物PI3Kpll0a蛋白在正常宫颈和CIN I组、CIN II组和CINIII组与宫颈浸润癌组织间均有显著性差异。说明在宫颈癌形成过程中存在PIK3CA的表达异常，而PIK3CA与宫颈不典型增生演化到宫颈癌有关，有可能成为宫颈癌早期诊断的指标。赫赛汀(Herceptin)是ー种抗HER2单克隆抗体，可选择性作用于人类表皮生长因子受体2 (HER2)，从而干扰癌细胞的生物学进程，抑制癌细胞的增生，赫赛汀用于治疗转移性乳腺癌，以及手术后的HER2阳性乳腺癌患者。研究发现赫赛汀对PIK3CA基因突变人群的疗效欠佳。PIK3CA基因突变检测可为乳腺癌患者的合理使用赫赛汀用药提供參考依据。PIK3CA热点区高突变率的发现对临床上肿瘤的诊断，预测预后和治疗有重要作用。为此，本领域技术人员也开发了一些检测PIK3CA基因突变热点区的方法和试剂，以增加肿瘤在组织学上的诊断敏感性。其中，检测PIK3CA基因突变的方法有传统的PCR-SSCP直接测序法。直接测序法的结果虽然具有客观性和特异性，但是它却存在以下缺点I、检测周期长，从标本送检到得出结果最短要48 — 72个小时左右；2、操作过程复杂，且要涉及到PCR扩增后的操作，因此易被污染，造成结果的不理想(详见F项)； 3、测序结果的判读较复杂、费时(当样本量大时，此点尤为突出，详见F项)；4、检测的敏感性不够高,Katsuhiko等人曾在2005年8月份出版的《LungCancer》上报道，如果突变基因的含量占基因组DNA总量的10%以下吋，则用直接测序法检测不到突变样本的存在；5、一次实验检测的样本量有限，最多只能8-24例；6、不安全，整个实验过程要用到多种有毒物质，如EB、丙烯酰胺等，对操作者和环境都有危害；7、费用较高(每个位点约需300元)。
技术实现思路
为了克服现有技术的缺陷，一方面，本专利技术所解决的技术问题在于提供ー种PIK3CA基因突变荧光定量PCR分型检测试剂盒。本专利技术的PIK3CA基因突变荧光定量PCR分型检测试剂盒，包括PCR混合反应液、阳性对照品和用于检测PIK3CA基因突变基因型的荧光探针，所述PCR混合反应液中包含扩增突变位点所处PIK3CA基因区段的PCR引物。优选地，所述突变位点位于PIK3CA基因的第9外显子和/或第20外显子；位于PIK3CA基因第9外显子的突变位点为PIK3CA基因第542和/或545核苷酸；位于PIK3CA基因第20外显子的突变位点为PIK3CA基因第1047核苷酸。其中，所述PCR引物包括以下两组引物对中的至少ー组针对PIK3CA基因第9外显子中突变位点所处区域的引物对，其PCR正向引物的序列如SEQ ID NO: I所示，PCR反向引物的序列如SEQ ID N0:2所示:Exon9F :5’-AGA ACA GCT CAA AGC AAT TTC TAC-3’ (SEQ ID NO:I)；Exon9R :5’-AAT CTC CAT TTT AGC ACT TAC CTG-3’ (SEQ ID NO:2)，针对PIK3CA基因第20外显子中突变位点所处区域的引物对，其PCR正向引物的序列如SEQ ID N0:6所示，PCR反向引物的序列如SEQ ID N0:7所示:Exon20F :5，-TAC ATT CGA AAG ACC CTA GCC T-3’ (SEQ ID N0:6)；Exon20R :5’-ATC CAT TTT TGT TGT CCA GCC-3’ (SEQ ID NO:7)。优选地，所述荧光探针包括如SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5, SEQ IDN0:8和SEQ ID N0:9所示的核苷酸序列中的至少ー种Exon9-542Probe :5，-FAM-TCA CTG AGC AGG AGA A-BHQ1-3，(SEQ ID NO :3);Exon9-545Probe :5，-HEX-ATT TCA GAG AGA GGA T-BHQ1-3，(SEQ ID NO :4);Exon9-WTProbe :5，-TAMRA-TCA CTG AGC AGG AGA A-BHQ 1-3，(SEQ ID NO :5);Exon20-1047MT :5，-FAM-TGA TGC ACG TCA TGG T-BHQ1-3，(SEQ ID NO :8);Exon20-1047WT :5’-HEX-TGA TGC ACG TCA TGG T-BHQ1-3’ (SEQ ID NO:9)。其中，针对PIK3CA基因第9外本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种PIK3CA基因突变荧光定量PCR分型检测试剂盒，其特征在于，包括PCR混合反应液、阳性对照品和用于检测PIK3CA基因突变基因型的荧光探针，所述PCR混合反应液中包含扩增突变位点所处PIK3CA基因区段的PCR引物。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：邵琦，
申请(专利权)人：广州达健生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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