本发明专利技术涉及辣椒疫霉纤维素合酶相关基因CesA3核苷酸点突变的鉴定及其在杀菌剂丁吡吗啉抗性监测中的应用，具体公开了一种鉴定辣椒疫霉CesA3基因3365位核苷酸突变对丁吡吗啉产生抗药性的分子检测方法及专用引物。该特异性引物对，由SEQ?ID?N0：2和SEQ?ID?NO：3所示的DNA分子组成。本发明专利技术提供的检测辣椒疫霉对杀菌剂丁吡吗啉抗药性的分子诊断方法，灵敏度高、稳定性好、检测周期短，可以用于高通量地监测田间辣椒疫霉对杀菌剂丁吡吗啉的抗性发生、发展情况，实现抗性病害的早期预警，对及时有效地控制抗药性病害的发展具有重要意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及辣椒疫霉纤维素合酶相关基因CesA3核苷酸点突变的鉴定及其在杀菌剂丁吡吗啉抗性监测中的应用，具体公开ー种快速鉴定辣椒疫霉CesA3基因的核苷酸点突变及其对丁吡吗啉抗药性的分子检测方法及专用引物。属于分子生物学
技术介绍
辣椒疫霉(Phytophthora capsici Leonian)是ー种重要的植物病原卵菌，由辣椒疫霉侵染辣椒引起的辣椒疫病，是ー种世界性分布的毁灭性病害，在我国普遍发生，且有逐年加重趋势。在气候适宜的的条件下，短期内就可爆发，蔓延速度极快，一般发病可引起30%产量损失，严重情况下可导致辣椒绝收。辣椒疫霉还可以侵染茄科、豆科、葫芦科等多种作物，引起产量损失。目前，在农业措施、抗病育种、生物防治、植物检疫和化学防治等诸多防治措施中，化学防治仍是控制植物病原卵菌病害的主要手段，在卵菌的病害防治中发挥着不可替代的作用。以甲霜灵为代表的苯酰胺类杀菌剂，成为卵菌病害化学防治的里程碑，然而，目前病原卵菌对该类杀菌剂已普遍产生抗药性，因此在生产实践中苯酰胺类杀菌剂的使用受到限制。丁卩比吗啉(pyrimorph)是2003年由中国农业大学创制的新型杀菌剂,在中国已获批临时登记，用于辣椒疫病和番茄晚疫病等卵菌病害的防治。丁吡吗啉的作用机制目前还不明确，但研究显示该药剂与CAA类杀菌剂具有交互抗药性，因此，推測丁吡吗啉与CAA类杀菌剂具有相似的作用机制。已有研究表明，与纤维素合成相关的蛋白酶cesA3是CAA类杀菌剂的作用靶标(朱书生等，2007 ；Blum etal. ,2010) 迄今，尚未发现辣椒疫霉对丁吡吗啉敏感性下降的报道。然而，毎年近20，OOOkg丁吡吗啉用于田间生产，且逐年增多。而且在室内条件下通过自然筛选和药剂驯化的方式获得了对丁吡吗啉产生高抗性水平的辣椒疫霉菌株，并且抗性菌株的生存适合度较高，表明具有较高的抗性风险。因此，在使用丁吡吗啉防治卵菌病害的过程中需要注意避免抗药性的产生，加强检测和早期预警病原菌对丁吡吗啉的抗性发生发展情况，这有助于指导丁吡吗啉的科学使用，延缓其抗药性的发生和发展，延长药剂的使用寿命。可以用于病原菌抗药性检测的常规方法包括菌丝生长测定法、菌丝干重測定法，孢子萌发测定法、琼脂展布法和抑菌圈测定法等。但是这些方法都需要通过离体条件下分离培养获得病原菌的纯培养物，測定药剂对病原菌的EC5tl，借助已建立的敏感基线，比较敏感和抗性菌株的差异，试验需要多个处理，多次重复，因此检测周期长、工作量大、消耗的人力资源和材料较多。而且上述常规方法检测灵敏度低，抗药性菌株的突变频率在I %以上才能被检测到。由于病原菌的繁殖、传播速度一般都很快，在自然界存在的数量有很大，因此经过几次药剂选择后,抗药性病原菌亚群体可能会成为致病病原群体的主体,造成病害大流行。随着分子生物学技术的飞速发展及其应用范围的不断扩展，限制性酶切PCR、等位特异PCR分子技术开始在病原菌抗药性检测中应用。与传统的检测方法比较，不但节省了检测时间(一般不超过4h)、提高了工作效率，而且提高了检测的灵敏度，检测频率在10_5 10_4，更适用于检测低频率的抗药性基因，因此也被作为田间抗药性早期诊断的理想方法。可以预测，分子检测技术将在病害的可持续管理系统中发挥愈来愈重要的作用。
技术实现思路
本专利技术的ー个目的是提供一种检测或辅助检测辣椒疫霉中CesA3基因是否存在突变位点的方法及其专用引物对。本专利技术所提供的检测或辅助检测辣椒疫霉中CesA3基因是否存在突变位点的方法，包括如下步骤以待测辣椒疫霉的基因组DNA为模板，用SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3所示引物对进行PCR扩增，若PCR扩增产物为168 bp的片段，则所述待测辣椒疫霉中CesA3基因存在或候选存在突变位点；所述突变位点指辣椒疫霉中CesA3基因的基因组序列自5’末端起第3365位核苷酸为A。所述CesA3基因的基因组序列自5’末端起第3365位核苷酸也就是SEQ ID NO 5中自5’末端起第3365位核苷酸。上述过程中，所述PCR扩增中，退火温度为58°C。本专利技术所提供的检测或辅助检测辣椒疫霉中CesA3基因是否存在突变位点的引物对，由SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3所示DNA分子组成。本专利技术的另ー个目的是提供辣椒疫霉中CesA3基因或蛋白的突变位点。本专利技术所提供的辣椒疫霉中CesA3基因的一个突变位点，为辣椒疫霉中CesA3基因的基因组序列自5’末端起第3365位核苷酸为A。所述CesA3基因的基因组序列自5’末端起第3365位核苷酸也就是SEQ ID NO :5中自5’末端起第3365位核苷酸。本专利技术所提供的辣椒疫霉中CesA3蛋白的一个突变位点，为辣椒疫霉中CesA3蛋白的自N端起第1077位氨基酸为赖氨酸。所述CesA3蛋白的自N端起第1077位氨基酸也就是SEQ ID NO :4中自N端起第1077位氨基酸。上述任一所述突变位点在鉴定辣椒疫霉抗药性中的应用也属于本专利技术的保护范围；所述抗药性为抗丁吡吗啉。上述应用中，存在所述突变位点的辣椒疫霉具有或候选具有抗药性。SEQ ID NO :4所示蛋白或SEQ ID NO :5所示基因也属于本专利技术的保护范围。本专利技术所提供的检测辣椒疫霉对丁吡吗啉产生抗药性的点突变的方法，有助于快速、灵敏地检测田间辣椒疫霉对丁吡吗啉的抗药性发生发展动态，为抗药性的治理提供技术支持，便于及时调整病害防治策略，以延缓和控制抗药性的进ー步发展。附图说明图I为抗丁吡吗啉的辣椒疫霉菌株及敏感菌株的cesA3基因DNA序列比较发现与抗性相关的ー个突变位点。Hd3和Hdll为敏感亲本菌株，R3-2，R3-3，Rll-I为抗性菌株。图2为采用特异性引物对扩增对丁吡吗啉敏感和抗性的辣椒疫霉菌株。引物对CF1077(SEQ ID NO I)+R1077 (SEQ ID NO :3)用于检测对丁吡吗啉的敏感和抗性的辣椒疫霉菌株，引物对R1077B(SEQ ID NO 2)+R1077 (SEQ ID NO :3)用于检测辣椒疫霉对丁吡吗啉的抗性菌株。其中Hd3，Hdll为辣椒疫霉敏感亲本菌株；R3-2，R3-3，Rll-I为抗性菌株。具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。文中“抗性菌株”均指对杀菌剂丁吡吗啉抗性的辣椒疫霉菌；“敏感菌株”均指对杀菌剂丁吡吗啉敏感的辣椒疫霉菌。下述实施例中使用的辣椒疫霉菌株为抗性菌株R3-2，R3-3，和Rll-I ;敏感菌株Hd3 和 HdlI。上述各个菌株均经过菌落生长测定法进行抗药性验证。上述菌株Hd3、Hdll、R3-2、R3_3和Rll-I采自中国河北地区。经过现有的形态学和分子生物学方法鉴定为辣椒疫霉。上述各个菌株均经过菌丝生长測定法进行抗药性验证。实施例I、辣椒疫霉对丁吡吗啉的敏感性测定三株辣椒疫霉抗性突变体，菌株编号分别为R3-2，R3-3，和Rll-I ;两株辣椒疫霉敏感亲本菌株，菌株编号分别为Hd3和HdlI。马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基马铃薯200g，琼脂粉13g，葡萄糖18g，蒸馏水定容至1L，121°C湿热灭菌20分钟。本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测或辅助检测辣椒疫霉中CesA3基因是否存在突变位点的方法，包括如下步骤：以待测辣椒疫霉的基因组DNA为模板，用SEQ？ID？NO：2和SEQ？ID？NO：3所示引物对进行PCR扩增，若PCR扩增产物为168bp的片段，则所述待测辣椒疫霉中CesA3基因存在或候选存在突变位点；所述突变位点指辣椒疫霉中CesA3基因的自5’末端起第3365位核苷酸为A。(所述CesA3基因的自5’末端起第3365位核苷酸也就是SEQ？ID？NO：5中自5’末端起第3365位核苷酸)。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘西莉，庞智黎，陈磊，邵菁芃，李健强，覃兆海，刘鹏飞，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：
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