本发明专利技术涉及一种香菇Cr02菌种的SSR标记指纹图谱及其构建方法与应用，该指纹图谱由7对SSR标记组成。构建方法包括：（1）菌丝培养；（2）基因组DNA的提取；（3）SSR分子标记的检测；（4）电泳检测。应用包括：对香菇菌种进行SSR标记扩增，将得到的带型与指纹图谱对照，与该指纹图谱一致即为香菇Cr02菌种。本发明专利技术与常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验相比，具有检测时间短、准确性高、可重复性好的优点，在收集的我国25个国审的香菇主栽菌种中具有香菇Cr02菌种的专一性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于香菇菌种的检测领域，特别涉及一种香菇Cr02菌种的SSR标记指纹图谱及其构建方法与应用。
技术介绍
我国香菇产量已从1983年的I. 95万吨迅速发展到2005年的242万吨，占全球香菇总产量的70%以上，改写了世界食用菌产量的排行榜，并不断缩小与排行第一的双孢蘑 菇产量差距，有专家预测，由于中国香菇产业的迅猛发展，在近10年内其将成为世界产量最高的食用菌。中国香菇以其惊人的发展速度，优质的品质及低廉的成本为世界菇业人士瞩目，中国香菇已风靡世界。优质菌种在香菇单产和质量中的贡献率举足轻重，这决定了香菇菌种在香菇产业中的重要地位。1999年我国签署了《国际植物新品种保护法》，这不仅要求我们尊重其它国家的品种知识产权，同时也要加强保护我们国家自己的品种知识产权，为了建立食用菌新品种登记制度来真正保护我国的品种产权，必须首先建立成熟的品种鉴定技术，为新品种登记奠定基础。尤其日本2004年4月I日开始实行《种苗法修正案》，对我国食用菌尤其是香菇的出口构成了极大的威胁。就国内而言，香菇栽培菌种“同种异名，异种同名”的现象，不仅给菇农带来了极大的损失，影响了他们的栽培积极性，也极大地影响了中国香菇的快速发展；而且，随着大规模的工厂化栽培方式的出现，对香菇栽培菌株质量的要求越来越高，需要发展更为简便、快速、准确的菌株鉴定技术，以保证每批次的用种都准确无误。面对这种局势，就需要我们进一步加快菌种鉴定技术的研究，在香菇的研究中引进更为有效的菌种鉴定体系。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种香菇Cr02菌种的SSR标记指纹图谱及其构建方法与应用，该指纹图谱与常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验相比，具有检测时间短，准确性高，重复性好的优点。本专利技术的一种香菇Cr02菌种的SSR标记指纹图谱，该指纹图谱由7对SSR标记组成，是基于香菇基因组简单重复序列片段开发SSR引物，扩增带型好，重复性高的SSR引物，标记详细信息如表I。表ISSR标记详细信息列表引物名称扩培的汛%￡丨￥列 iH/反句引物 Tmfc)Le—fpOOOl (CT)7 ACGCGTATCCTCCCCTAAGT/ 60 '_AAGCGATATGGATTTGACGC_.....Lejp002............(CGAC)6GGGCGAAACAATTTCAGGTA/60 —ATGCCATCGTAAGG AACTCGLe^ip0003 (('T)9ATTGTGA(:.'TC'G,\C( ACCTCX:■/60 —TC\VrAATGCArCCCGTG.AGALe Γρ0004 (AGGT)5(TCAAAAAGGATTTCAGCAA..60 JLJr A- & JLJL JL Α. 3l X , ^Lej'p0()05 (TAC')7tatgiaga(C}GAT)6 C ATC AACC AAACC AAGAUC λΑ； 60ΤΤΓΓΑΑΤΤΤΓΓΤΓΓΟΑΠΤΓΑJL 贏*■ % · He Jit M- A \cgi— Jhi> Sk JL s4 SfcLe—fp0006 (TCA)6C ATGGG AG AG ATTCGG AA AA/60 CXi AC； ACf X iΛ( G ACTTTCiΛ( TLe^ijX)()()7 (( T( K) t ΑΙ Χ,ΓΚ. (.C-AK CHX Al IV 60_TA( ( i(.(i'iC.i( (iCiA( i i KiAI_本专利技术的一种香菇Cr02菌种的SSR标记指纹图谱的构建方法，包括(I)菌丝培养将香菇菌种转接到马铃薯葡萄糖培养基I3DL中，23°C 25°C下避光摇瓶培养，3cT4d后收集菌丝；(2)基因组DNA的提取用CTAB (十六烷基三甲基溴化铵)法提取上述菌丝的基因组DNA，紫外分光光度法检测总基因组DNA浓度和纯度，调整样品DNA的浓度一致；(3) SSR分子标记的检测对上述提取的DNA进行基因SSR标记的PCR扩增；(4)电泳检测将上述PCR扩增得到的产物与加样缓冲液混匀，变性，点样于变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，银染，显色，拍照，分析结果。所述步骤(2)中的CTAB法提取菌丝的基因组DNA具体工艺包括(I)将_20°C冷冻干燥的香菇菌丝研磨成粉末，加入65°C预热的2XCTAB抽提液，于65°C保温45 60min，轻摇混匀；(2) 12000rpm、4°C离心 20min，取上清液；(3)在上述上清液中加入体积比为25 24 1的酚、氯仿和异戊醇的混合液，混匀IOmin, 12000rpm、4°C离心IOmin,取上清液移入离心管中；(4)在上述离心管中加入体积比为24 1的氯仿和异戊醇混合液，混匀lOmin，12000rpm、4°C离心lOmin，取上清液移入另一离心管中；(5)在上述离心管中加入2/3体积(相对于步骤(4)中的上清液)的_20°C预冷的异丙醇，摇动5min, 8000rpm、4°C离心lOmin,去上清；(6)将得到的沉淀用75vol%乙醇和10mmol/L醋酸钾洗涤2 3次，每次8000rpm，室温离心5min ；(7)加入预冷的95vol%乙醇,上下颠倒,8000rpm室温离心IOmin,弃乙醇,真空抽干或自然晾干；(8)加入 100 μ L 10ΧΤΕ (Tris/EDTA)缓冲液，使沉淀溶解；(9)加入 I μ L I Omg/mL 的 RNaseA 于 37°C 水浴 lh，去除 RNA ；(10)将得到的DNA提取物于_20°C贮藏备用。所述步骤(3)中的PCR扩增体系为总体积20 μ L，包括10XPCR buffer 2 μ L， 25mmol/LMgCl2 2 μ L, 10mmol/L dNTP 0. 4μ L,5U/y L Taq DNA 酶 O. 2 μ L，10 μ mol/L SSR标记正向引物和反向引物总体积各I. 5 μ L，浓度20ng 30ng/ μ L提取的模板DNA2 μ L，ddH20 10. 4 μ L ;PCR 反应条件94°C 5min ；94°C 30second, 55°C 30second, 72°C 30second, 30 个循环；72°C 5min。所述步骤(4)中的加样缓冲液Loading buffer为2μ L ;PCR扩增产物点样量为3 μ L0所述步骤(4)中的变性的具体工艺为于95°C变性5min，结束后置于冰水混合物中冷却3min。所述步骤(4)中的电泳的工艺参数为变性聚丙烯酰胺凝胶的体积百分比浓度为6%,电泳缓冲液为I XTBE，电压ΙΟΟΟν，电流200mA，功率200W，电泳45min。所述步骤(4)中的银染的具体工艺为电泳完成后卸下并拆开玻璃板，胶板卸下后，用去离子水水洗5-8秒，浙干水分后，在银染液中避光银染8分钟，银染后，用去离子水水洗5-8秒，浙干水分，放入显影液中，至显影后取出水洗后即可读数。银染液、显影液均可用3-4次。该银染显影方法是常规方法的简化，在高通量试验中较为高效实用。 所述银染液的组成为I. 5克硝酸银和1500ml水；显影液的组成为16克氢氧化钠、IOOOml水和8ml甲醛。本专利技术的一种香菇Cr02菌种的SSR标记指纹本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种香菇Cr02菌种的SSR标记指纹图谱，其特征在于：该指纹图谱由7对SSR标记组成，具体序列如下：Le_fp0001正向引物：ACGCGTATCCTCCCCTAAGT；反向引物：AAGCGATATGGATTTGACGC；Le_fp0002正向引物：GGGCGAAACAATTTCAGGTA；反向引物：ATGCCATCGTAAGGAACTCG；Le_fp0003正向引物：ATTGTGACTCGACCACCTCC；反向引物：TCATAATGCATCCCGTGAGA；Le_fp0004正向引物：CCCAAAAAGGATTTCAGCAA；反向引物：AACCGGAGTGGTGTAAGTGC；Le_fp0005正向引物：CATCAACCAAACCAAGATTCAA；反向引物：TTCCAATTTCCTCCGAGTCA；Le_fp0006正向引物：CATGGGAGAGATTCGGAAAA；反向引物：CGAGACCGACGACTTTGACT；Le_fp0007正向引物：CATTGCTCGGATCCTTCATT；反向引物：TACCTCGTGCGGACTTTGAT。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张丹，章炉军，巫萍，谭琦，尚晓冬，宋春艳，鲍大鹏，杨慧，
申请(专利权)人：上海市农业科学院，
类型：发明
国别省市：
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