本发明专利技术公开了检测ALDH2基因多态性的引物、探针和试剂盒，属于基因多态性位点检测技术领域。该引物的核苷酸序列包括突变型ARMS上游引物SEQ ID NO:1、野生型ARMS上游引物SEQ ID NO:2以及公用的下游引物SEQ ID NO:3和公用的Taqman探针。本发明专利技术的试剂盒还包括内控基因的扩增引物和Taqman探针。本发明专利技术所提供的引物和探针以及由其构成的试剂盒能够用于临床多种类型样本的检测，具有特异性强，灵敏度高，实验周期短，操作简单，安全无毒，成本低等显著优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因多态性检测
，具体涉及检测ALDH2基因多态性的引物、探 针和试剂盒。
技术介绍
人类乙醛脱氢酶(aldehyde dehydrogenase gene,ALDH)是一种四联体蛋白，催化 乙醛和其他脂肪族醛氧化，目前已经发现19种ALDH基因，在其19种同工酶中，存在于肝脏线 粒体内的ALDH2活性最强。 ALDH2具有乙醛脱氢酶的活性，是人体内酒精代谢的关键酶，能够将有害产物乙醛 转化为无害的乙酸，从而起到解毒的作用。ALDH2同时也具有硝酸酯酶活性，临床上治疗及 预防冠心病心绞痛的常用药物硝酸甘油也是由其代谢的，硝酸甘油经ALDH2代谢，释放一氧 化氮(NO)，N0能激活鸟苷酸环化酶，使平滑肌和其他组织内的环鸟苷酸(CGMP)增多，导致肌 球蛋白轻链去鳞酸化，调节平滑肌收缩状态，引起血管扩张，从而有效预防冠心病和心绞 痛。 人类ALDH2基因位于12号染色体，包含13个外显子，其12号外显子1510位 (rs671SNP)的鸟嘌呤(G)突变为腺嘌呤(A)时，导致该基因编码蛋白504位的谷氨酸(Glu)替 换为赖氨酸(Lys)，即Glu504Lys(rs671)。这个位点突变使ALDH2失去结合辅酶的能力，造成 酶活性的丧失，严重影响酒精、硝酸甘油等的代谢。人群中该酶基因型有3种情况，具有正常 催化活性的野生纯合子型:ALDH2*1/1;活性下降的杂合子型:ALDH2*l/2(约为正常ALDH2活 性的6.25% )，催化活性失去的突变纯合子型ALDH2*2/2。同时ALDH2表现出明显的遗传多态 性，在不同的地域、民族、人种中其频率不同。其在欧美白种人中少见，而在中、日、韩等东亚 黄种人中突变率高达30%~50%。 研究显示，在饮酒人群中，尤其是重度饮酒者，ALDH2基因多态性与酒精性中毒、酒 精性肝病(alcoholic liver disease，ALD)、消化道癌症等疾病密切相关，ALDH2*2突变人 群患肝癌、食道癌、口腔癌的概率分别是ALDH2*1野生人群的3倍、12.95倍、11.72倍以上， ALDH2*2突变是增加区域性癌化几率的重要因素之一。另外，ALDH2*2突变导致硝酸甘油代 谢速率大大降低，从而无法产生一氧化氮，难以发挥药效。因此对ALDH2基因突变的检测能 够指导人们根据自己的基因型正确饮酒，从而减少酒精引起的身体伤害，真正做到健康饮 酒。也能为医生合理使用硝酸甘油提供有力参考，减少用药无效导致的意外死亡。 目前，针对ALDH2基因多态性检测的方法有多种，最简单的方法是PCR-RFLP，但该 方法操作复杂，样本多时易造成PCR产物的交叉污染且容易出现酶切不充分或酶切过度而 出现假阴性或假阳性的结果，可靠性低。DNA测序法虽然是金标准，但步骤繁琐，过程复杂， 容易出现样本间的交叉污染而导致测序失败，另外测序仪价格超出了一般临床检验实验室 的承受范围。高分辨率溶解曲线法，快速，简便，经济实用，但是受仪器温度控制，假阳性高。
技术实现思路
为了解决现有技术中对于ALDH2基因检测方法的上述不足，本专利技术在Taqman探针 法的基础上提供一种具有高灵敏度、高特异性、高准确度、高精确度、操作方法简单的ALDH2 多态性位点的引物和探针。 本专利技术提供的检测ALDH2基因多态性的引物和探针，其探针为公用的Taqman探针， 其核苷酸序列5'端标记报告基团，3'端标记淬灭基团；引物的核苷酸序列如下： 突变型ARMS上游引物： SEQ ID N0:l(5'-TCCCACACTCACAGTTATCACGTT-3'）； 野生型ARMS上游引物： SEQ ID N0:2(5'-TCCCACACTCACAGAATTCACTTC-3'）；公用的下游引物： SEQ ID N0:3(5'-GGTCAACTGCTATGCTCTGATTGG-3'）。 上述引物针对G1510A位SNP位点设计。引物及探针使用的具体原理是:针对突变位 点分别设计野生型和突变型ARMS引物和Taqman探针，结合荧光定量PCR反应，对从人外周血 细胞或口腔拭子等组织中提取的基因组DNA进行检测，通过实时荧光PCR仪上收集信号，计 算野生型和突变型的ACt值来确定样本DNA的基因型。 优选地，探针的核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示，5'端标记的报告基团为FAM，3'端 标记的淬灭基团为MGB。 探针SEQ ID N0:4:5'-FAM/CCGTACTCCCCAAC T/MGB-3'。 本专利技术还提供了一种检测ALDH2基因多态性的试剂盒，其包括权利要求1或2所述 的检测ALDH2基因多态性的引物和探针。 优选地，还包括内控引物和内控Taqman探针，核苷酸序列如下： 内控上游引物： SEQ ID N0:5(5，-TCCCGACCACACGCGACT-3，)； 内控下游引物： SEQ ID N0:6(5'-ACCTTCGTGCTGGAGCACAT-3'）； 内控 Taqman 探针： SEQ ID NO:7; Taqman探针的核苷酸序列5'端标记报告基团，3'端标记淬灭基团。优选地，报告基团为J0E，淬灭基团为BHQ1。 SEQ ID N0:7(5'-J0E-CAACGCTCCGCTCCACAAACTCATCATA-BHQl-3'） 所述内控基因碱基序列为NCBI数据库中基因序列编号为NM_001204889.1第818到 1117位。上述引物是针对该段序列设计的。这段序列是ALDH2基因第9外显子上的一段序列， 与目的基因是同一个基因，不仅可以作为试剂盒的质控，还可以作为样本DNA的质控，保证 提取出来的DNA包含ALDH2基因，可以排除其他序列的非特异交叉反应，同时它也不会对目 的基因产生交叉反应，确保试剂盒的准确性。 优选地，还包括阳性质控品，阳性质控品为含有ALDH2G1510A野生型基因序列、 G1510A突变型基因序列以及内控基因序列的DNA混合物，内控基因序列如SEQ ID N0:8所 不。 优选地，上述的检测ALDH2基因多态性的试剂盒，其中的试剂分为四类： (1)ALDH2基因突变型检测液：至少含有SEQIDN0:1、SEQIDN0:3的引物和核苷 酸序列为SEQ ID NO: 4的探针，以及内控引物和内控Taqman探针，dNTPs，PCR缓冲液； (2)ALDH2基因野生型检测液：至少含有SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3的引物和核苷 酸序列为SEQ ID NO: 4的探针，以及内控引物和内控Taqman探针，dNTPs，PCR缓冲液； (3)阳性质控品； (4)DNA 聚合酶。 PCR缓冲液为现有技术已知，可以自行配制或者直接购买市售商品（例如商品名通 常为10XPCR buffer)，其含有帮助PCR过程顺利进行的盐离子如Mg2+和其他化学成分。 优选地，上述的检测ALDH2基因多态性的试剂盒，其中的试剂分为三类： (1)ALDH2基因突变型检测液：至少含有SEQIDN0:1、SEQIDN0:3的引物和核苷 酸序列为SEQ ID N0:4的探针，以及内控引物和内控Taqman探针，dNTPs，PCR缓冲液，ABI公 司的产品Fast maste本文档来自技高网...
【技术保护点】
检测ALDH2基因多态性的引物和探针，其特征在于，探针为公用的Taqman探针，其核苷酸序列5’端标记报告基团，3’端标记淬灭基团；引物的核苷酸序列如下：突变型ARMS上游引物：SEQ ID NO:1；野生型ARMS上游引物：SEQ ID NO:2；公用的下游引物：SEQ ID NO:3。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：胡利红，吴志伟，夏琦，段卫涛，赵平锋，
申请(专利权)人：武汉海吉力生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。