本发明专利技术提供一种与苹果斑点落叶病抗性相关的SNP分子标记，所述SNP分子标记位于用于调控苹果斑点落叶病抗性的miRNA初级转录本Md‑MIRLn12‑277的启动子上，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，该序列的378bp处碱基为T的苹果品种对苹果斑点落叶病的抗性显著高于此处碱基为G的苹果品种。可将其作为苹果属栽培品种对苹果斑点落叶病抗性的分子标记，用于筛选苹果斑点落叶病抗性资源和选育抗性苹果品种。
【技术实现步骤摘要】
与苹果斑点落叶病抗性相关的SNP分子标记及其应用
本专利技术涉及植物分子生物学领域，具体地说，涉及一种与苹果斑点落叶病抗性相关的SNP分子标记及其应用。
技术介绍
苹果斑点落叶病是苹果最主要真菌性病害之一，可通过向叶片释放各类毒力因子和效应因子影响植物代谢，使叶片出现过氧化物积累和细胞死亡。一系列研究表明，植物的抗病机制是病原菌侵入植物时，首先是位于细胞质膜的受体激酶会在识别病原菌后激活下游MAPK等信号途径使植物产生抗病性(PTI途径)；由于植物的抗病性使得病原菌会进化出一系列效应因子来克服植物的抗病性；为了识别病原菌的效应因子，植物也演化出一系列抗病基因(R基因)，激活抗病反应(ETI途径)，而miRNA是调控抗病基因的重要调控因子。传统方法采用药剂防治病害会影响食品安全或造成环境污染。通过设计特异性引物进行PCR扩增并测序的鉴定方法可筛选苹果斑点落叶病抗性资源，选育抗性苹果品种是解决这一问题的最有效途径。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种与苹果斑点落叶病抗性相关的SNP分子标记及其应用。本专利技术以感病品种‘金冠’为试材利用miRNA二代测序筛选出接种苹果斑点落叶病AlternariaAlternariaf.spmali(ALT1)前后表达差异2倍以上的miRNA，获得一个新的miRNA，将其命名为Md-miRLn12(SEQIDNO:5)。由于苹果感病品种叶片接种ALT1后Md-miRLn12及其初级转录本Md-MIRLn12-277表达会明显升高，但抗性品种无显著变化；因此克隆比较了二者Md-MIRLn12-277及其启动子区，发现抗性品种与感病品种Md-MIRLn12-277序列相同，但启动子区存在3个碱基不同，其中-1186bpSNP位点是决定Md-MIRLn12-277启动子活性的位点。因此，专利技术人通过这个SNP位点开发了选育抗斑点落叶病苹果品种的分子标记。为了实现本专利技术目的，本专利技术与苹果斑点落叶病抗性相关的SNP分子标记，所述SNP分子标记位于用于调控苹果斑点落叶病抗性的Md-miRLn12的初级转录本Md-MIRLn12-277的启动子上，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，该序列的378bp处碱基为T的苹果品种对苹果斑点落叶病的抗性显著高于此处碱基为G的苹果品种。用于调控苹果斑点落叶病抗性的Md-miRLn12的初级转录本Md-MIRLn12-277的核苷酸序列如SEQIDNO:4所示。本专利技术还提供用于检测所述与苹果斑点落叶病抗性相关的SNP分子标记的引物，包括正向引物F5’-AACACAGGGAGCACTTCTATTG-3’和反向引物R5'-GTCCGTTATTATACGAATAATTGG-3'。本专利技术还提供所述与苹果斑点落叶病抗性相关的SNP分子标记在鉴定苹果斑点落叶病抗性品种及感病品种中的应用，包括以下步骤：1)提取待测苹果植株的基因组DNA；2)以待测苹果植株的基因组DNA为模板，利用所述引物F和R，进行PCR扩增反应；3)检测PCR扩增产物，如果扩增产物序列中378bp处的碱基为T，则待测苹果植株属于苹果斑点落叶病抗性品种；如果扩增产物序列中378bp处的碱基为G，则待测苹果植株属于苹果斑点落叶病感病品种。具体可根据测序碱基差异和测序峰图判断不同苹果栽培品种对苹果斑点落叶病抗性。抗性品种中，Md-MIRLn12-277启动子序列-1186bp处为T，测序峰图为T单峰；中性品种中，Md-MIRLn12-277启动子序列-1186bp处G和T同时存在，测序峰图为G和T套峰；感病品种中，Md-MIRLn12-277启动子序列-1186bp处为G，测序峰图为G单峰。本专利技术还提供含有所述引物的用于检测苹果斑点落叶病抗性苹果品种的试剂盒。本专利技术还提供所述与苹果斑点落叶病抗性相关的SNP分子标记在苹果分子标记辅助育种中的应用。本专利技术还提供一种用于调控苹果斑点落叶病抗性的Md-miRLn12的初级转录本Md-MIRLn12-277，其核苷酸序列如SEQIDNO:4所示。该基因编码的成熟miRNA为Md-miRLn12(SEQIDNO:5)。在苹果斑点落叶病感病苹果植株中抑制Md-miRLn12的表达，可提高感病品种对苹果斑点落叶病的抗性；同时，在苹果斑点落叶病抗性苹果植株中过表达Md-miRLn12，可降低抗性品种对苹果斑点落叶病的抗病性。本专利技术还提供一种表达载体，所述表达载体上携带含有Md-miRLn12的模拟靶标串联序列(STTM，序列如SEQIDNO:6所示)的表达盒。携带有所述目的基因的表达载体可通过使用Ti质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞中(Weissbach，1998，MethodforPlantMolecularBiologyVIII，AcademyPress，NewYork，第411-463页；Geiserson和Corey，1998，PlantMolecularBiology，2ndEdition)。本专利技术进一步提供Md-miRLn12在调控苹果斑点落叶病抗性中的应用，利用基因工程的手段，通过抑制Md-miRLn12在苹果斑点落叶病感病苹果植株中的表达，从而提高感病植株对苹果斑点落叶病的抗性。在本专利技术的一个优选实施方式中，将合成的Md-miRLn12的模拟靶基因串联序列(STTM，序列如SEQIDNO:6所示)构建到pFGC5941载体上(NcoI和BamHI酶切位点之间)，采用农杆菌(GV3101)介导的方法，在感病苹果品种中瞬时表达，可提高转基因植株的抗病性。本专利技术具有以下优点：本专利技术可以有效解决药剂防治苹果斑点落叶病病害影响食品安全或造成环境污染等问题，通过设计特异性引物进行PCR扩增并测序的鉴定方法，解决了选育抗性品种的问题，并且可以筛选苹果斑点落叶病抗性资源，同时也解决了果树转基因，杂交技术较难，耗时长且不方便鉴定的问题。本专利技术提供的方法快速、灵敏，准确性高，简便，能够应用于苹果属植物。附图说明图1为本专利技术实施例1接种ALT1后1小时、2小时、24小时和48小时，Md-miRLn2分别在抗性品种‘寒富’和感病品种‘金冠’表达变化，以不接菌表达量作为对照(0小时)。图2为本专利技术实施例2在感病品种‘金冠’中沉默Md-miRLn12可以增强感病品种抗病性。其中，A：载体示意图；B：农杆菌介导的瞬时表达感病品种‘金冠’组培苗4天后接菌，接种48小时后通过Northern检测Md-miRLn12表达量；C：农杆菌介导的瞬时表达感病品种‘金冠’组培苗4天后接菌，接种48小时后检测发病率及病症；WT代表不进行瞬时表达‘金冠’组培苗；SC代表划伤不进行瞬时表达‘金冠’组培苗；EV代表pFGC5941空载进行瞬时表达‘金冠’组培苗；STTM-Md-miRLn12代表沉默Md-miRLn12的pFGC5941载体进行瞬时表达‘金冠’组培苗。图3为本专利技术实施例2在抗病品种‘寒富’中过表达Md-miRLn12可以降低抗病品种抗病性。其中，A：载体示意图；B：农杆菌介导的瞬时表达抗性品种‘寒富’组培苗4天后接菌，接种48小时后通过Northern检测Md-miRLn12表达量；C：农杆菌介导的瞬时表达抗性品种‘寒富’组培苗4天后本文档来自技高网...
【技术保护点】
与苹果斑点落叶病抗性相关的SNP分子标记，其特征在于，所述SNP分子标记位于用于调控苹果斑点落叶病Md‑miRLn12的初级转录本Md‑MIRLn12‑277的启动子上，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，该序列的378bp处碱基为T的苹果品种对苹果斑点落叶病的抗性显著高于此处碱基为G的苹果品种。
【技术特征摘要】
1.与苹果斑点落叶病抗性相关的SNP分子标记，其特征在于，所述SNP分子标记位于用于调控苹果斑点落叶病Md-miRLn12的初级转录本Md-MIRLn12-277的启动子上，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，该序列的378bp处碱基为T的苹果品种对苹果斑点落叶病的抗性显著高于此处碱基为G的苹果品种。2.用于检测权利要求1所述与苹果斑点落叶病抗性相关的SNP分子标记的引物，其特征在于，包括正向引物F5’-AACACAGGGAGCACTTCTATTG-3’和反向引物R5'-GTCCGTTATTATACGAATAATTGG-3'。3.权利要求1所述与苹果斑点落叶病抗性...
【专利技术属性】
技术研发人员：李天忠，张秋雷，张懿，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京,11
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